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红笛鲷(Lutjanus sanguineus)广泛分布于红海、非洲东岸、菲律宾和日本等沿海地区,在我国主要分布于台湾海峡、琼州海峡、海南岛、北部湾等海域,是我国沿海的重要养殖鱼类之一。近年来随着海水鱼类养殖密度的不断增大和环境的日益恶化,海水鱼弧菌病频繁爆发,其中由哈维氏弧菌引发的弧菌病给红笛鲷养殖业造成了巨大的经济损失。因此,开展弧菌病的免疫防治研究显得非常迫切。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)表面特有的外膜蛋白(outermembraneproteins,omps),在维持细菌细胞结构的稳定、细胞间物质交换及细菌的致病等过程发挥重要的作用,同时一些病原细菌的外膜蛋白具有很好的免疫原性,能够激发宿主产生多种免疫应答反应,可作为疫苗研制的重要成分。白细胞介素(interleukin)是一类重要的细胞因子,它与细胞间的相互作用,能够扩大和调节多种免疫应答,同时有些细胞因子又可做为疫苗的分子免疫佐剂,增强DNA疫苗免疫效果。本研究首先应用RACE-PCR技术克隆出红笛鲷IL-6基因的cDNA序列,然后通过PCR扩增获得它的DNA序列,同时对其进行了生物信息学分析。结果表明IL-6基因cDNA序列全长1307 bp,包含一个完整开放阅读框(open reading frame,ORF)为639 bp,编码212个氨基酸,预测其分子量为24.0 kDa,理论等电点为5.65。氨基酸同源性分析显示,红笛鲷IL-6与斜带石斑鱼IL-6氨基酸同源性高达53%,亲缘关系最近。红笛鲷IL-6的DNA序列全长3447 bp,含有5个外显子,4个内含子。为了研究IL-6基因经哈维氏弧菌活菌刺激后在红笛鲷体内各组织的表达情况,我们运用Real-time PCR技术,分析显示IL-6在头肾、胸腺、脾脏主要免疫器官都能检测相应mRNA的表达,并且三种组织在6-18 h会出现不同程度的最高表达量。同时将IL-6去信号肽的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,IPTG诱导IL-6在大肠杆菌中高效表达相应蛋白,Western-blot验证融合蛋白正确性;然后将纯化的重组蛋白免疫昆明系小鼠,制备鼠抗IL-6多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:40000,Western-blot验证鼠抗血清能与IL-6融合蛋白发生特异性免疫反应。鼠抗IL-6血清的免疫组织化学分析显示,IL-6主要分布于红笛鲷头肾、胸腺、脾脏器官淋巴细胞的细胞质中。哈维氏弧菌的多种外膜蛋白都具有较好的免疫原性,据国内外相关研究报道显示,OmpW具有较好的免疫效果;因此我们首先PCR扩增获得该基因序列,同时运用重叠延伸剪切技术,将红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌的OmpW两个基因嵌合,嵌合基因全长1263bp,预测其分子量为46.2 kDa;最后将嵌合基因定向插入到原核表达载体pET-32a(+),对其进行原核表达,Western-blot分析发现嵌合基因编码蛋白能与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性结合。为了进一步研究IL-6做为DNA疫苗分子佐剂的作用,我们同时将IL-6、OmpW和嵌合基因IL6-OmpW定向整合到真核表达载体pcDNA3.1(+),分别将三个真核质粒肌肉注射红笛鲷,然后从核酸水平和蛋白水平分别检验基因的表达。RT-PCR和PCR检测三个质粒在红笛鲷组织分布和表达情况,结果表明:质粒免疫红笛鲷第7和28d后,三个基因无论是DNA水平还是RNA水平,都会在鱼体头肾、脾脏、肝脏和肌肉组织中表达。间接ELISA和Western-blot方法从蛋白水平检测蛋白表达情况,结果表明:三个重组质粒免疫后,红笛鲷血清内存在相应重组蛋白的抗体,说明DNA疫苗免疫后,目的蛋白诱导产生了相应的抗体。攻毒保护实验结果表明,重组质粒pcDNA-IL6、pcDNA-OmpW和pcDNA-IL6-OmpW对红笛鲷的免疫保护率分别为:36%、60%和76%,表明三者对鱼体都有一定的免疫保护作用,同时证明了 IL-6是一种具有较好免疫增强效果的分子佐剂。