背景与目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种世界性的慢性肝病,它包括一系列连续性疾病,可以从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化,甚至肝细胞肝癌(HCC)。肝纤维化是NAFLD发展过程中重要的病理生理过程。由于其具体的发病机制尚不清楚,目前仍无特效的治疗方法。肝纤维化的发生取决于肝星状细胞(HSCs)的活化。静态的HSCs内储存大量的脂滴(LDs),慢性肝损害时,HSCs被激活,并伴随着大量LDs的丢失以及过量的α-SMA和胶原蛋白的产生,导致细胞外基质(ECM)增多而触发肝纤维化。所以,细胞内脂肪的丢失被认为是HSCs活化的重要标志。Perilipin 5(Plin5)作为Perilipin家族中新发现的LDs相关蛋白,在肝脏、褐色脂肪组织(BAT)、心脏和骨骼肌等氧化组织中高度表达。已有研究表明,Plin 5在调节LDs代谢和细胞内脂质平衡中发挥着重要作用,但其在HSCs激活过程中的具体作用和机制尚不清楚。本课题拟采用体外实验,即分离和培养原代小鼠HSCs,分析不同片段的Plin 5对LDs形成的影响,探讨全长Plin 5与HSCs中LDs形成和HSCs活化之间的关系,为治疗和逆转肝纤维化提供新的靶点。方法(1)根据相关文献,将Plin 5 c DNA截短成不同的片段,扩增并装入Lenti-p FLRu-YFP载体,制备不同长度的Plin 5病毒感染细胞,测定各片段的功能,本实验中均使用全长的Plin 5;(2)高脂高果糖饮食诱导脂肪肝合并肝纤维化小鼠模型,real-time PCR检测HSCs中Plin 5和collagen的含量;体外用real-time PCR和western blot方法分别检测培养1天和7天HSCs中Plin 5的含量;(3)重组慢病毒p FLRu-PLIN 5或载体慢病毒p FLRu-YFP转导活化HSCs,real-time PCR和western blot方法检测HSCs中脂质含量;(4)Leica DM 4000B荧光显微镜观察外源性Plin 5对HSCs中LDs形成的影响;(5)用real-time PCR和western blot方法检测外源性Plin 5对HSCs激活标志物表达的影响;(6)MTS方法检测外源性Plin 5对HSCs生长情况的影响,并采用western blot方法检测外源性Plin 5对细胞周期相关基因和生长相关基因表达的影响。结果(1)Plin 5的氨基酸1-116(aa1-116)的结构域显示出抑制HSCs的激活、促进LDs的形成和增加细胞内TG和FA的含量,剩余大部分Plin 5的氨基酸117-463(aa117-463)结构域的表达未显示出该功能;(2)Plin 5在体内体外活化HSCs中减少(P<0.05);(3)外源性Plin 5增加HSCs中FA和TG的含量(P<0.05);(4)外源性Plin 5促进了HSCs中LDs的形成;(5)外源性Plin 5降低了纤维化相关基因α-SMA、collagen I蛋白的表达(P<0.05),增加了PPARγ的表达(P<0.05);(6)外源性Plin 5抑制HSCs的生长(P<0.05)并显著降低了细胞周期相关基因Cyclin D1和细胞生长相关基因PDGF-βR、CTGF、TGFβ-RI和TGFβ-RII的表达。结论(1)Plin 5发挥作用的主要功能区域位于Plin 5的氨基酸1-116(aa1-116)的结构域中;(2)Plin 5能够促进HSCs中LDs的形成、增加细胞脂肪含量并抑制HSCs的活化和生长。