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牙髓牙本质复合体构成牙齿的主体，受到外界刺激后牙髓中的牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)可分化为成牙本质细胞并分泌牙本质基质，最终形成继发性牙本质保护牙髓。损伤修复的具体机制是目前牙髓生物学亟待阐明的关键问题。细胞外基质磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE)是短整联蛋白黏合性配体互动糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycolproteins，SIBLINGs)蛋白家族的新成员，主要表达于骨组织、牙齿组织以及肾近球小管中，与体内钙磷平衡和牙体硬组织的形成矿化密切相关，是牙本质发育缺陷的重要候选基因。本研究推测在牙髓损伤修复过程中，MEPE作为细胞外基质蛋白，可能通过某些信号转导途径，影响其他骨诱导因子的合成和分泌，调节DPSCs的增殖分化和牙髓牙本质复合体的修复再生。本课题组前期研究检测了人牙髓细胞(human dental pulp cells，hDPCs)诱导分化过程中矿化标志的表达，发现MEPE与牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)mRNA水平同步上调，与人骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)诱导分化的表达情况相似。因此，本研究拟检测MEPE对hDPCs增殖、成牙本质分化和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的影响，揭示MEPE在牙髓损伤修复中的作用机制。
目的：研究MEPE对hDPCs增殖和成牙本质分化能力的影响，揭示其在牙髓损伤修复中的功能。
方法：
①采用酶消化组织块法进行hDPCs的原代培养；不同浓度rhMEPE(0、2.5、5、25、50、250、500ng/mL)作用hDPCs 1、2、3d，以0ng/mL组为对照组，CCK-8法检测细胞的增殖情况；不同浓度rhMEPE(0、5、10、50、100ng/mL)结合矿化诱导hDPCs 21d，以未矿化组及0ng/mL组为对照组，实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、DSPP、骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)、Collagen Ⅰ mRNA表达水平；选取rhMEPE最佳浓度结合矿化诱导hDPCs0、7、14、21d，以矿化0d为对照组，实时荧光定量RT-PCR检测BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表达水平。
②构建Ad5-MEPE-EGFP载体，测定病毒滴度；用不同MOI(100，200，500，1000，2000)Ad5-MEPE-EGFP转染hDPCs48h，荧光显微镜下观察细胞形态并计算平均转染率，筛选最适MOI；以最适MOI转染hDPCs 3、7、14、21d后，实时荧光定量RT-PCR及Western Blot检测细胞MEPE表达。
③以最适MOI的Ad5-MEPE-EGFP转染hDPCs 1、3、7、10d后，CCK-8法检测细胞增殖情况；转染hDPCs 1、3、7、10、14、21d后，检测细胞内ALP活性；转染hDPCs 7、14、21d后，实时荧光定量RT-PCR检测BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表达水平，Von Kossa染色观察矿化结节形成情况。
结果：
①酶消化组织块法可有效进行hDPCs的原代培养；CCK-8结果显示随着rhMEPE作用时间延长，各实验组OD值升高，与对照组相比有统计学差异(p＜0.05)；矿化诱导21d，各浓度组BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA表达均较对照组(未矿化组及0ng/mL组)上调，与未矿化组相比均有统计学差异(p＜0.05)，除100 ng/mL组外(p＞0.05)，其他浓度组中BSP、DSPP、OCN、CollagenⅠ基因表达与0ng/mL组比较差异均有统计学意义(p＜0.05)；各实验组中以5ng/mL组作用最明显，各目的基因表达较其他浓度组显著性升高(p＜0.05)；5ng/mL组矿化诱导7、14、21d，各基因表达量均较对照组上调，21d时达最大值(p＜0.05)。
②检测Ad5-MEPE-EGFP病毒滴度为2.0×1010 IU/mL，EGFP表达量随着MOI值增加而增高，根据平均转染效率及细胞形态选取最适MOI=500用于后续实验，其转染效率为(80.204±1.589)％；转染7d时细胞MEPE mRNA表达最高，随后逐渐降低，在21d时未能检测到MEPE mRNA表达。Western Blot验证以上结果。
③CCK-8结果显示Ad5-MEPE-EGFP转染hDPCs1、3d后OD值均高于未转染组，3d有统计学意义(p＜0.05)，随后OD值降低且低于未转染组，10d时有统计学差异(p＜0.05)；在各时间点实验组ALP活性均高于未转染组，10d时达到最大值；转染后各目的基因表达量均较未转染组上调，BSP mRNA在14d时表达最高，DSPP、OCN、Collagen Ⅰ mRNA在7d时最高，且均较另外两个时间点(14d和21d)显著性上调(p＜0.05)，空白转染组与未转染组间无统计学差异(p＞0.05)；Von Kossa染色示Ad5-MEPE-EGFP转染组出现大小不等的褐色矿化结节，21d时矿化结节数量最多，结节体积最大。
结论：外源性rhMEPE及Ad5-MEPE-EGFP转染均能促进hDPCs增殖、BSP、DSPP、OCN、Collagen Ⅰ基因表达上调和ALP活性升高，提示MEPE可能通过调控hDPCs的增殖和成牙本质分化能力，在牙髓损伤修复中发挥重要作用。