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1.猪繁殖与呼吸综合征病毒山东分离株ORF7基因的克隆、鉴定及原核表达猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的一种新的病毒性传染病。N蛋白抗原表位是PRRSV抗原分型的主要依据,也是血清型鉴别诊断的抗原基础。本研究在以下两个试验表达了美洲型特异的N蛋白抗原表位基因,旨在为山东PRRS的鉴别诊断方法的建立奠定抗原基础。本研究通过从山东某猪场患败血症仔猪的肺脏、淋巴组织中分离到1株PRRSV,流行特征表现为仔猪出现严重的呼吸道症状,该病毒能在Marc-145细胞上生长,但不能在Vero、BHK21、PK15等细胞上增殖,分离毒适应Marc-145细胞后,产生以皱缩、脱落、崩解为特征的细胞病变,分离毒在Marc-145细胞第四代为107TCID50/ml,初步将分离毒鉴定为PRRSV SD-1株。然后根据PRRSV VR-2332株的基因序列,设计能够扩增美洲型的N蛋白抗原表位基因的一对含有BamHI和EcoRI双酶切位点的引物,经RT-PCR技术从提取的SD-1株病毒RNA中扩增出大小为366bp的N基因,并将其成功的克隆进pMD-18T载体,筛选出了含有ORF7基因的重组质粒,从而为进一步的表达奠定了基础。测序显示PRRSV SD1株ORF7基因的序列与PRRSV VR2332株基因序列完全一致,符合率达99%以上,与欧洲株的同源性不到60%。说明目前山东省流行株为美洲型,为预防该病在山东的流行提供理论依据。通过PCR方法从阳性重组质粒pMD-18T-N扩增ORF7基因,将此基因克隆到原核高效表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组质粒pGEX-6P-1-N。将该重组质粒转化入宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达后SDS-PAGE分析表明在34kD处出现了目的条带。确立了最佳诱导表达条件(IPTG 1mM、作用时间4h),目的蛋白利用Amersham的GST纯化试剂盒对表达产物进行过柱纯化,最终获得了高浓度的重组N蛋白。经Western-Blot免疫印迹分析,该表达产物与美洲型PRRSV血清发生反应,说明N蛋白抗原表位基因获得了高效表达。2.用一步法RT-PCR技术快速检测PRRSV方法的研究