目的:听觉皮层的组织结构对听觉信息加工和整合是至关重要的,然而最近的在体双光子钙成像实验因为使用不同的钙指示剂而得出了有争议性的结论,可能是因为不同的钙指示剂的敏感度和性能不同,因此确定一个可靠的钙指示剂对听觉皮层在体双光子成像是非常必要的。为了更加理解听觉皮层的功能组织,我们使用先前报道过的钙指示剂Cal-520,它能在麻醉和清醒动物中都可以很好的工作。Cal-520拥有足够的敏感度和高信噪比来探测单个动作电位。在麻醉和清醒动物中,听觉皮层神经元都能产生自发活动或声音引起的神经活动,经过一系列频率的纯音测试后,我们确信了小鼠初级听觉皮层的局部异质性,进一步我们又通过Cal-520钙成像的方法探究了神经元对节律性刺激的预测行为,发现小鼠初级听觉皮层对节律性刺激存在预测行为,并且具有频率选择性。因此在在体听觉皮层功能成像实验中,Cal-520是既可靠又实用的钙的指示剂。方法:麻醉小鼠双光子成像:在麻醉状态下,暴露右侧的初级听觉皮层进行双光子成像。每只小鼠用1.5%的异氟烷麻醉,并安置在温暖的平台上(37.5–38℃),局部注射利多卡因,然后移除初级听觉皮层表面附着的皮肤和肌肉,我们使用UHU胶水将自制的塑料固定槽黏在暴露的颅骨上,然后开骨窗(2 mm×2 mm)。随后将小鼠转移到成像平台下,并用较低浓度的异氟烷保持麻醉状态(0.4-0.8%),呼吸每分钟90-130次。开骨窗处充满1.5%低溶点的琼脂糖。固定槽盛满人工脑脊液(混有95%氧气和5%二氧化碳后p H值为7.4)。接下来,我们用高灵敏度的荧光钙指示剂Cal-520 AM在初级听觉皮层进行气压注射标记。脂溶性Cal-520溶解在DMSO中,并加入20%F-127,配成最终浓度567μM。标记一小时后进行钙成像,成像最多可达8小时。整个实验过程中,小鼠的体温维持在36.5–37.5℃。清醒小鼠双光子成像:在头部固定的清醒小鼠双光子成像实验中,我们使用一个自制的塑料固定槽,粘在暴露的颅骨表面,小鼠需要恢复5天时间。在这阶段,小鼠需要训练3-5天以适应实验台,每天训练1-4小时,小鼠的头部和身体需要以前后轴心翻转大约70°,以保证初级听觉皮层垂直于显微镜物镜,经过训练后,小鼠会逐渐适应这个姿势并且可以稳定的保持4个小时。实验当天在麻醉状态下开(2×2 mm)的骨窗,用来做Cal-520的标记,照相机(帧频30 Hz)用来监视小鼠的状态。我们使用声音刺激器给出噪音或者不同频率的纯音,记录初级听觉皮层神经元的反应。结果:1.Cal-520初级听觉皮层神经元在体双光子钙成像:Cal-520的钙信号可以可靠地代表动作电位,成功率可接近100%。2.麻醉小鼠听觉皮层神经元的自发反应和声音引起的反应:我们随机采集一些神经元和附近的神经纤维网的信号,发现神经纤维网没有神经元的信号。此外,我们也选取了神经纤维网的一部分区域和它周围的神经元区域作为对比,发现神经元的信号没有受到神经纤维网的污染。麻醉小鼠初级听觉皮层2/3层细胞的自发反应频率非常低,频率低于0.1 Hz。对宽频噪音刺激的反应变化很大,有的成功率为0,有的则可以变化到100%(平均为43%;12只小鼠共1263个神经元),其中有45%的神经元对噪音刺激的反应可高于50%,43%的神经元成功率低于50%,12%的神经元没有反应。3.在清醒小鼠中,初级听觉皮层神经元的自发反应和噪音引起的反应实验中,清醒小鼠和麻醉小鼠情况类似,初级听觉皮层神经元的自发活动的频率也是非常低,变化从0到0.3 Hz。噪音刺激中,初级听觉皮层2/3层神经元平均的反应率为34%,比麻醉状态小鼠略低,但是每个神经元对声音刺激的反应同样变化很大,变化范围可从0到100%,其中有30%的细胞成功率高于50%,59%的细胞成功率低于50%,11%没有反应。4.小鼠麻醉和清醒状态下,初级听觉皮层对纯音的反应:无论在麻醉还是清醒状态下,初级听觉皮层神经元对纯音都有更大的反应,并出现单峰的声音曲线,并且在相似的最佳频率范围内神经元没有成簇的空间分布。此外,在麻醉和清醒动物中,相对频率相差0到1个音阶的神经元之间的最大距离可达到200 mm,这些结果表明在初级听觉皮层的局部环路中,没有确定的拓扑结构,而是异质性的结构分布。5.小鼠麻醉和清醒状态下,初级听觉皮层对有节律性的刺激可以产生预测信号,并且这个预测信号是有频率选择性的。同样在相对应的听声音舔水的行为学试验中,有节律性的刺激也会引起小鼠的预测性舔水。结论:1.Cal-520在麻醉和清醒状态下都可以很好的工作,并且有很高的信噪比和足够的灵敏度探测单个动作电位。2.麻醉小鼠初级听觉皮层神经元的自发活动的频率非常低,对宽频噪音刺激的平均反应率为43%,变化范围从0变化到100%。3.清醒小鼠初级听觉皮层神经元的自发活动的频率也非常低,对宽频噪音刺激的平均反应率为34%,变化范围从0到100%。4.在初级听觉皮层的局部环路中,没有确定的拓扑结构,而是异质性的结构分布。5.小鼠初级听觉皮层神经元对节律性刺激会产生预测的信号,同样,相对应的行为学也会引起预测性行为。