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目的/背景:我国结直肠癌的死亡率随着生活水平的提高而不断提高,已经成为主要的恶性肿瘤死因之一。生物治疗,包括免疫、基因治疗等新兴手段是趋势及希望所在。成功的免疫、基因治疗应该是最大限度地杀伤肿瘤细胞而保护正常细胞的治疗方法。成功的肿瘤免疫治疗有赖于合适的肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens,TAA)的选择。一个理想的TAA应该具备下述特征:1)TAA应该在大部分肿瘤病人的大部分肿瘤细胞中有表达;2)TAA应该能够诱导特异识别肿瘤而非正常细胞的T细胞;3)最重要的是,TAA应该是肿瘤细胞赖于生存的重要分子。抗这种TAA的免疫才可以克服肿瘤细胞因抗原变异而逃避免疫反应,因为一旦丢失这种生存分子,肿瘤细胞就会死亡。Survivin就是符合上述条件的少数几种分子之一。首先,Survivin的过表达见于大部分实体和血液肿瘤;其次,Survivin能够激发特异的机体免疫反应;第三,顾名思义,作为存活素的Survivin是肿瘤细胞生存的必需蛋白。这些发现提示Survivin是一种良好的肿瘤--基因或免疫治疗靶基因,能够成为免疫治疗中有价值的TAA,但表达Survivin蛋白的肿瘤细胞能够在机体内存活,说明该蛋白某些抗原决定簇也可能诱发机体的免疫耐受。因此保留Survivin致凋亡的关键片断,并尽量去除非必要潜在免疫耐受片断是充分利用Survivin来进行抗肿瘤治疗的关键。研究发现的C端Survivin序列含有大部分的Survivin基因的免疫活性多肽,同时具有第84位半胱氨酸(CyS)这个关键位点。第84位半胱氨酸突变为丙氨酸则造成内源性Survivin分子移位,引起细胞有丝分裂障碍(Mitotic catastrophe)和凋亡。以上研究表明第80氨基酸残基以后的C端Survivin序列能够介导其主要功能和免疫原性。可以作为肿瘤治疗的新靶点。因此本研究的目的是:在以往克隆的全长Survivin野生型载体的基础上构建仅含C端62(81-142)个氨基酸残基的表达载体(第84位突变或不突变),评价其对大肠癌细胞株的治疗作用。方法:1)运用PCR技术,从pCDNA3.1-sur(既往实验已经构建完成)中扩增出第80位氨基酸残基以后的C端Survivin序列,克隆入真核表达载体pEGFP-C1。构建pEGFP-C1-Csur重组质粒。通过测序与GeneBank目标序列比对;2)运用定点突变技术,将pEGFP-C1-Csur及pCDNA3.1-Msur/T34A(既往实验已经构建完成)中的第84位半胱氨酸定点突变为丙氨酸。构建真核表达载体pEGFP-C1-MCsur/C84A及pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A。通过测序与GeneBank目标序列比对;3)应用半定量RT-PCR法、免疫蛋白印迹法检测重组质粒pCDNA3.1-sur、pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A、pEGFP-C1-Csur、pEGFP-C1-MCsur/C84AC端Survivin mRNA及蛋白的表达情况;4)利用荧光显微镜结合荧光染料Hoechst 33258检测瞬时转染重组质粒的大肠癌细胞株Lovo的凋亡情况;5)、应用流式细胞仪测结合碘化丙啶定(Propidium Iodide,PI)检测瞬时转染重组质粒的Lovo细胞的生长周期。结果:1)扩增含有C端Survivin基因片断,并克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建成重组质粒(pEGFP-C1-Csur)。重组质粒(pEGFP-C1-Csur)经双酶切(HindⅢ/BamHⅠ)及PCR鉴定插入片断大小正确,测序鉴定与GeneBank中Survivin编码序列比对同源性为100%。2)定点突变重组质粒pEGFP-C1-MCsur/C84A及pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A通过测序与GeneBank目标序列比对,突变位点正确,突变成功。3)各重组质粒的半定量RT-PCR检测及免疫蛋白印迹法检测显示表达重组质粒mRNA以及蛋白的大小与预计相符。在半定量RT-PCR检测中,若以Survivin灰度值/GAPDH灰度值表达mRNA相对表达量,则Lovo(未处理)及空质粒组仅显示本底浓度(癌细胞本身是表达Survivin的)为0.246±0.023及0.263±0.011,重组质粒pCDNA3.1-sur、pEGFP-C1-Csur、pEGFP-C1-MCsur/C84A、pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A组的mRNA相对表达量分别为0.454±0.058、0.627±0.028、0.736±0.137、0.450±0.054,PCR产物浓度明显高于2对照组,P=0.00。在pEGFP-C1-Csur组及pEGFP-C1-MCsur/C84A组出现了31kd的融合蛋白条带和16.5kd的Survivin条带,而其他组只出现了Survivin条带,说明pEGFP-C1-Csur组及pEGFP-C1-MCsur/C84A组C端sruivivn/EGFP融合蛋白表达成功。4)Hoechst33258染色观察凋亡发现瞬时转染pEGFP-C1-MCsur/C84A及pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A能促进Lovo细胞凋亡,瞬时转染pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1-sur、pEGFP-C1-Csur不能明显促进细胞凋亡。5)PI染色观察细胞周期发现Lovo(未处理)、空质粒组、pCDNA3.1-sur组、pEGFP-C1-Csur组、pEGFP-C1-MCsur/C84A组及pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A组的G1细胞周期分别为(46.34±3.67)%、(42.38±1.60)%、(47.75±1.79)%、(48.81±4.60)%、(54.52±2.62)%、(60.52±1.30)%。其中前4组处于G1期的细胞百分数均明显少于后2组(P=0.00),同时瞬时转染pEGFP-C1-MCsur/C84A的Lovo细胞处于G1期的细百分数少于转染pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A的Lovo细胞,P=0.024。结论:1)应用基因重组及定点突变技术成功构建了pEGFP-C1-Csur、pEGFP-C1-MCsur/C84A、pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A真核表达载体,并在大肠癌细胞株Lovo中成功表达。2)体外实验证明第84位半胱氨酸(Cys)定点突变为丙氨酸(Ala)(C84A)的Survivin拮抗Lovo野生型Survivin基因抑制凋亡的作用,这种作用在C端Survivin基因C84A(pEGFP-C1-MCsur/C84A)以及全序列Survivin基因T34A/C84A(pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A)的情况下相似。而C端Survivin野生型基因(pEGFP-C1-Csur组)引起癌细胞凋亡的作用不明显。Survivin基因在缺乏N端情况下至少仍然可以部分行使其凋亡抑制作用,而这种凋亡抑制作用可以被第84位的C84A所拮抗。3)C84A将癌细胞阻滞于DNA合成前期(G1),使细胞难以进入正常的有丝分裂期,细胞增殖减少。这种情况在pEGFP-C1-MCsur/C84A及pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A的情况下有相似的趋势,但在pCDNA3.1-Msur/T34A—C84A组更明显,而在pEGFP-C1-Csur组不明显。综上说明第80氨基酸残基以后的C端Survivin序列能够介导其主要生物学功能,对该段基因第84位定点突变(C84A),可以起到促进Lovo细胞凋亡,并将细胞阻滞于G1期的作用。