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细胞凋亡作为细胞的基本生物学现象之一,在人及动物的生命过程中起着重要的作用。当细胞发生凋亡时,凋亡细胞的主要生物化学组成(核酸、蛋白质与脂类等)会发生相应的变化,同时检测出生物分子结构及含量信息的变化对研究细胞凋亡具有十分重要的意义。红外光谱作为一种研究物质化学组成的有力工具,逐渐应用于生物医学领域。红外光谱能够提供生物大分子的吸收谱带,敏锐地检测出它们的相对含量、构象等在凋亡过程中的变化,这是常规检测细胞凋亡的方法无法做到的。利用红外光谱研究细胞的凋亡过程,可以为细胞凋亡提供新的研究与检测手段。 在本论文中,我们对三氧化二砷诱导肺癌细胞A549凋亡开展了研究。 该论文取得的主要实验结果如下: 1.As2O3作用于A549细胞的凋亡检测 (1)MTT法检测细胞增殖率: 采用不同浓度的As2O3(0、4.8、9.6、14.4、19.2、24μg/ml)作用于A549细胞24h,发现随着As2O3浓度的增加,细胞增殖率逐渐下降,具有差异显著性(**P<0.01),由此表明As2O3能够抑制A549细胞活性,且呈剂量依赖关系。 (2)划痕实验 采用9.6μg/ml As2O3对作用A549细胞的迁移能力进行研究,发现8h后,实验组的划痕距离没有明显变化,而对照组的划痕距离开始减小;12h后对照组划痕距离逐渐减小,而实验组的划痕距离始终变化不大,表明As2O3可能影响肺癌细胞A549的迁移能力。 (3)流式细胞仪检测凋亡率 As2O3作用于A549细胞24h后,细胞经Annexin V-FITC/PI双染后利用流式细胞仪检测实验组和对照组的凋亡率,发现实验组的凋亡率明显升高,且具有差异显著性(***P<0.001)。 (4)细胞生长曲线 采用9.6μg/ml As2O3作用于A549细胞,分别在4h、8h、12h、24h后通过细胞计数观察两组细胞数的变化。发现在4-24h时间段,对照组随着时间的延长细胞数目持续增多,实验组细胞数目逐渐减少,表明As2O3可能造成了肺癌细胞的损伤(**P<0.01)。 (5)荧光染色 实验组通过Annexin V-FITC/PI试剂染色后,用荧光显微镜观察到有凋亡细胞出现。 (6)细胞线粒体膜电位 As2O3作用于A549细胞24h后,经罗丹明123染色后上流式细胞仪检测,发现A549细胞在As2O3的作用下,线粒体膜电位明显下降。 (7)细胞Caspase-3的酶活性检测 药物作用A549细胞24h后,分别于4、8、12、24h收集实验组与对照组细胞,利用Caspase-3试剂盒检测细胞内Caspase-3含量的变化,发现实验组Caspase-3的含量明显高于对照组相比,且随着时间的延长该趋势更加明显。 (8)DNA琼脂糖凝胶电泳 药物作用于A549细胞24h后,通过电泳发现实验组出现典型的DNA梯形条带,表明As2O3能够诱导A549细胞凋亡。 2.As2O3作用于A549细胞的红外光谱研究 (1)峰面积比 通过对实验组与对照组A1640/A1531,A1531/A972,A972/A1743,A1395/A1452和A1081/A1229进行计算与分析,发现:实验组A1640/A1531低于对照组,表明凋亡细胞蛋白质的二级结构发生了变化;实验组A1531/A972低于对照组,表明凋亡细胞的蛋白质与DNA含量均可能降低,而且蛋白质含量降低的速度快于DNA含量降低的速度;实验组A972/A1743低于对照组,表明凋亡细胞的脂质含量增多;实验组A1395/A1452低于对照组,表明凋亡细胞的脂质结构发生了变化。实验组A1081/A1229高于对照组,表明凋亡细胞的核酸结构发生了变化。 (2)曲线拟合 选择2975-2830cm-1和1130-1000cm-1区域,通过高斯公式对红外光谱的二阶导数曲线进行曲线拟合。实验组A2875/A2850低于对照组,表明在细胞凋亡过程中CH2相对于CH3的数目增加,脂肪烃链也可能发生了变化;实验组A1082/A1049高于对照组,表明在细胞凋亡过程中核酸/碳水化合物的结构或含量可能发生变化。 本论文的研究结果表明As2O3能够诱导肺癌细胞A549凋亡,为从分子层面上探究肺癌细胞凋亡的机制、监测细胞凋亡的过程提供了一定的帮助。