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鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染肠道所引起的传染性原虫病,给世界各地的养鸡业带来巨大的经济损失。至今为止,我国公认艾美耳球虫有7种,其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的感染力和致病力最强。目前对球虫病的主要控制办法还是在饲料或饮水中的添加抗球虫药物,如地克珠利(Diclazuril,DIC),饲料中仅添加1 mg/kg就可以达到很好的治疗效果,但药物的长期使用会导致球虫产生耐药性,所以本研究通过对田间分离的DIC耐药株进行一系列研究,并通过同工酶谱、随机扩增多态DNA(RAPD)以及DIC潜在作用靶点甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的mRNA表达等角度来分析耐药性产生的可能机制,为更好地防治球虫病提供理论依据。具体研究内容如下:1、田间柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株的分离本试验为收集了来自江苏、山东、福建、安徽、河南等5个不同地区共13个发病鸡场的粪便样本,并从中分离纯化出其中的E.tenella。为评价13个分离株对DIC的耐药性设立DIC敏感株(SE)作为对照。试验时对每个虫株分别设置感染用药组、感染不用药组和空白对照组,以抗球虫指数、病变记分减少率、相对卵囊产量、最适抗球虫活性百分率四项指标进行综合评定。结果显示来自江苏南通地区虫株中有6株对DIC表现出不同程度的耐药性,有5株表现为重度耐药;河南开封分离株对DIC表现重度耐药;山东地区仅有1株对DIC轻度耐药,其余分离株均对DIC表现敏感。2、南通地区E.tenella分离株耐药性分析本试验选取南通地区5株重度耐药分离株(NT1、NT2、NT3、NT4、NT5)进行体外DIC抗球虫孢子化效果检测,同时运用同工酶技术以及随机多态性DNA分析法对其耐药性进行进一步分析。试验结果表明,与SE株相比,耐药株均可以显著抵抗DIC对球虫孢子生殖抑制;但除NT3的LDH、GPI以及G6PD同工酶与SE有明显差异外,其余耐药株与SE株之间无明显差异,推测耐药性与同工酶谱的变化关系不大。DNA多态性分析发现,有4株耐药株与SE株之间相似度在60%左右,存在较大的差异;NT5与SE之间相似度达到80%以上,差异较小,推测发生了某些关键变化,故选取NT5进行进一步研究。3、NT5分离株耐药性产生的分子机制初探本试验通过鸡体感染试验研究NT5和SE在DIC的刺激下在体内的发育情况,并检测DIC潜在作用靶点GAPDH和LDH的表达情况。试验共分为5组,分别是空白对照组(Con)、NT5攻毒模型组(NT5),SE攻毒模型(SE),NT5攻毒+DIC治疗组(NT5+DIC),SE攻毒+DIC治疗组(SE+DIC),在感染后的96 h、120 h、144 h、168 h分别采集各组盲肠样品制作组织病理切片观察,检测并比较感染后96h、120h、144h时盲肠组织内的球虫GAPDH、LDH基因mRNA表达变化。病理切片结果显示,DIC处理使SE球虫出现二代裂殖体异常发育以及合子发育异常等情况,并使二代裂殖子数量大量减少;但NT5球虫仅出现少量卵囊发育异常,在其余发育阶段均未发现明显异常。mRNA检测结果显示在球虫体内发育过程中,DIC处理引起SE株球虫内GAPDH的表达量显著上升,而LDH表达量下降;而NT5株球虫在96 h、120 h时,LDH和GAPGH的mRNA表达量均显著下降,说明此时NT5株球虫内的糖酵解代谢途径被DIC抑制,但仍可继续正常发育;在144h时,NT5株GAPDH mRNA表达量显著上升,可能与NT5株球虫在此阶段出现卵囊发育异常有关。经测序后发现,NT5株与SE株的GAPDH蛋白在氨基酸链C端的最后18个氨基酸完全不同,提示NT5株GAPDH基因可能发生突变。综上所述,敏感株虫体使用DIC治疗后,GAPDH mRNA的高表达可能是造成虫体在裂殖生殖阶段与配子生殖阶段发育异常的原因。耐药球虫使用DIC治疗后,GAPDH mRNA表达量降低。NT5株耐药性的产生可能与GAPDH mRNA表达差异有关,是否与GAPDH基因突变相关仍需进一步研究。