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哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是一类具有生防潜力的丝状真菌,其厚垣孢子制剂为其未来最具潜力的开发方向。厚垣孢子显著特征为细胞壁增厚,而几丁质作为菌丝及孢子细胞肇的主要成分,对维持细胞的结构和功能具有重要作用,其合成关键酶为几丁质合成酶(chitin synthase,CS,EC2.4.1.16)。因此,研究木霉菌几丁质合成酶基因,探索几丁质合成机制,对于研究细胞壁形成过程,进而开发以厚垣孢子为主要成分的木霉菌制剂具有重要意义。本文通过扩增哈茨木霉中的几丁质合成酶基因,构建几丁质合成酶突变体,观察表型变化,初步探究其功能,结果如下:
1.克隆几丁质合成酶基因ThChsC片段及其全长
将NCBI上注册的23株丝状真菌几丁质合成酶基因的序列进行blast比对,找到保守序列,以此为基础设计简并引物,以哈茨木霉基因组作为模板,进行PCR扩增得到长度为372bp的序列。在NCBI上进行Blast比对,发现与申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)的几丁质合成酶基因(L24910.1)相似性为91％。故在此基础上进行染色体步移,共扩增得到4110bp。
2.生物信息学分析几丁质合成酶基因ThChsC序列
生物信息学比对结果表明ThChsC(GenBank登录号HQ419000),编码区(CDS)长为2835bp,由4个外显子和3个内含子组成,开放阅读框(ORF)长2688bp,编码895个氨基酸。进行序列比对及同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉(Gibberella moniliformis,ACY08039.1)和禾生刺盘孢菌(CoUetotrichum graminicola,AAL23718.1)几丁质合成酶基因相似性最高,分别为80％、81％；相应的氨基酸序列同源性均为80％,系统进化分析表明ThChsC属于Ⅲ型几丁质合成酶亚家族。ThChsC含有1个Chitin_synth_1结构域,1个Chitin_synth_1N结构域,1个Chitin_synth_2结构域,3个跨膜结构域,为膜结合蛋白。预测三维结构表明其含有糖基转移酶的保守DHD结构域。
3.构建几丁质合成酶基因丁hChsC突变体
以潮霉素基因作为筛选标记,在其两侧插入ThChsC的5’-侧翼序列(长度为1417bp)和ThChsC的3’-侧翼序列(长度为1024bp)作为同源臂；采用酶切-连接法,将构建的重组片段与双元载体pDHt／sk相连构建打靶载体pDHt／ThChsC::hph;采用农杆菌介导转化法(ATMT)将打靶载体导入哈茨木霉Th-33基因组中,根据同源重组原理,使潮霉素基因表达盒替换ThChsC,共得到162株假定转化子。经过连续五次传代培养后,116株仍具有潮霉素抗性,转化效率达到71.6％。
4.筛选几丁质合成酶基因7hChsc敲除突变体
通过扩增3’和5’侧翼序列以及被敲除的序列,筛选得到几丁质合成酶基因ThChsC敲除突变体6-2；以潮霉素基因为探针,以敲除突变株6-2以及具有表型差异的转化子4-1,3-3,2-2,5-1,3-2,2-9与野生型基因组DNA为模板,进行Southern blotting分析,检测T-DNA插入情况。
5.分析几丁质合成酶基因ThChsC敲除突变体6-2的表型变化情况
以野生型菌株为对照,将菌丝进行Fluorescent Brightener28染色后,荧光显微镜下观察发现,野生型菌株菌丝内部染色均匀且深,在隔膜处染色更深,而突变体菌丝中染色较浅,说明ThChsC缺失后,几丁质合成量明显减少。此外,显微观察发现,突变体6-2的菌丝内部径向膨大形成厚垣孢子；分生孢子梗分支减少,长度增长；但生长速度,产色素量,产孢量与野生型没有明显区别。