目的:本课题以中药经典方“茵陈蒿汤”为模型药物,建立以Ⅱ相葡萄糖醛酸结合反应为主要代谢途径的中药复方有效成分的药代动力学研究方法,基于胆红素代谢关键酶和转运子的活性测定,研究茵陈蒿汤、有效成分（京尼平、大黄素）对胆红素代谢的促进作用,揭示茵陈蒿汤利胆作用与其方中有效成分的葡萄糖醛酸化过程或葡萄糖醛酸结合物形成的相关性,从而阐释其利胆保肝作用的物质基础和作用机制。方法:1.采用UPLC-DAD技术,对茵陈蒿汤中14种活性成分（京尼平苷酸,鸡矢藤次苷甲酯,绿原酸,京尼平龙胆双糖苷,咖啡酸,栀子苷,对羟基苯乙酮,西红花苷I,西红花苷II,芦荟大黄素,大黄酸,大黄素,大黄酚,大黄素甲醚）进行含量分析,为后续茵陈蒿汤主要有效成分的体内代谢过程和药效机制研究打下基础。2.利用UPLC/Q-TOF-MS技术,对口服茵陈蒿汤大鼠血浆、胆汁、粪便及尿液中的活性成分原型及其II相代谢物进行鉴定,在此基础上,采用UPLC-MS/MS和硫酸酯酶酶解技术,考察茵陈蒿汤中活性成分原型和II相代谢物在正常和胆汁淤积大鼠体内的药代动力学差异,以研究茵陈蒿汤治疗胆汁淤积的物质基础。3.采用预防给药的方式,以临床公认的治疗胆汁淤积的阳性药物UDCA为参照,考察三个口服剂量（6.0、9.0、12 mg/kg）茵陈蒿汤对ANIT所致的胆汁淤积模型大鼠的治疗作用,研究中利用LC-MS/MS技术对各组大鼠肝脏中药物代谢酶UGT1A1和其他9种转运子（MRP2、BSEP、OCT1、NTCP、MATE1、MDR1/Pgp、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4）进行平行反应监测,结合血清指标ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA的含量,以及肝脏病理切片结果,对茵陈蒿汤治疗ANIT所致的胆汁淤积模型大鼠的作用进行综合性评价。4.建立胆红素体外葡萄糖醛酸结合反应体系,以公认的胆红素葡萄糖醛酸结合抑制剂埃罗替尼、索拉菲尼、阿扎那韦对反应体系进行验证,并在此反应体系的基础上,对茵陈蒿汤在体内的主要II相代谢成分京尼平、大黄素对胆红素葡萄糖醛酸结合的抑制情况进行考察,验证其对胆红素体内代谢的影响。5.采用预防给药的方式,以临床公认的治疗胆汁淤积的阳性药物UDCA为参照,分别考察两个口服剂量（40、60 mg/kg）的京尼平、大黄素对ANIT所致的胆汁淤积模型大鼠的治疗作用,研究中利用LC-MS/MS的方法对各组大鼠肝脏中药物代谢酶UGT1A1和其他9种转运子（MRP2、BSEP、OCT1、NTCP、MATE1、MDR1/Pgp、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4）进行平行反应监测,结合血清指标ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA的含量,对胆汁流速的影响,以及肝脏病理切片结果,对茵陈蒿汤入血成分京尼平、大黄素治疗ANIT所致的胆汁淤积模型大鼠的作用进行综合性评价。结果:1.结果表明,UPLC-DAD测定茵陈蒿汤中14种成分的方法学实验结果均符合样品分析要求。测定结果显示茵陈蒿汤（水煎浓缩液,1g生药/ml）中14种成分的含量分别为为京尼平龙胆双糖苷9274μg/m L、栀子苷2242μg/m L、咖啡酸631.7μg/m L、绿原酸280.1μg/m L、大黄酸260.0μg/m L、西红花苷I 85.5μg/m L、对羟基苯乙酮79.7μg/m L、芦荟大黄素68.3μg/m L、鸡屎藤次苷甲酯60.0μg/m L、京尼平苷酸42.6μg/m L、大黄素23.6μg/m L、大黄酚10.8μg/m L、大黄素甲醚2.3μg/m L、西红花苷II 0.8μg/m L。2.利用UPLC-Q/TOF-MS检测到了口服茵陈蒿汤大鼠体内的7种原型化合物,如大黄酸、鸡屎藤次苷甲酯、栀子苷、京尼平、咖啡酸、对羟基苯乙酮、大黄素,以及19种代谢产物,其中包括8种II相代谢产物,如大黄酸的葡萄糖醛酸结合物,对羟基苯乙酮的硫酸结合物,京尼平、大黄素、咖啡酸的葡萄糖醛酸和硫酸结合物。对酶解前11个原型化合物和酶解后4个II相代谢物的UPLC-MS/MS检测方法进行的方法学验证考察,包括专属性、线性、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、稳定性考察,结果均符合要求。利用上述检测方法,考察了8种活性成分原型和4种II相代谢物分别在正常和胆汁淤积大鼠体内对药代动力学,结果表明大黄酸、大黄素和京尼平的II相代谢产物在正常和胆汁淤积大鼠组中的药代动力学行为有显著差异,在胆汁淤积大鼠中,大黄酸和大黄素的AUC_（0-∞）值分别比正常大鼠下降了74.7%和64.4%,K_a和K_e数据的比较表明,胆汁淤积大鼠中大黄酸和大黄素II相代谢物的吸收和代谢被显著抑制,类似于原型药物的代谢行为。然而,与正常大鼠相比,京尼平的AUC_（0-∞）和C_max值分别增加了241.1%和97.6%,K_a和K_e数据的比较表明,胆汁淤积大鼠中京尼平II相代谢物的吸收和代谢强于正常大鼠,与京尼平苷酸和栀子苷的原型表现出相同的药代动力学行为,但与其他II相代谢物和原型化合物的药代动力学行为展现出了明显的差异。3.茵陈蒿汤治疗胆汁淤积的药效实验结果表明,对比于正常对照组,ANIT模型组表现出了显著的胆汁淤积病理特性,包括肝损伤血清指标ALT、AST、TBIL、DAIL、TBA的显著性升高,通过组织病理切片观察到的明显的肝细胞损伤,胆汁流量的减少,以及肝药酶UGT1A1和转运子MRP2、BSEP、OCT1、NTCP、MDR1、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4的表达减弱。在药物治疗组中,12.0 g/kg剂量的茵陈蒿汤对于胆汁淤积大鼠有最明显的治疗效果,如ALT、AST的显著降低,TBIL、DAIL、TBA分别下降了26.1%、29.4%、16.6%;胆汁流速从模型组的0.18±0.03μL/min/100 g增加为0.48±0.02μL/min/100 g,且肝细胞损伤情况也得到了明显的减轻;对于II相代谢酶UGT1A1而言,相比于模型组,高剂量茵陈蒿汤组升高了2.4倍,MRP2、BSEP、OATP1A2、OATP1A4、OCT1、NTCP分别升高了2.4、1.6、1.6、1.3、1.8、2.0倍,表现出了最好的治疗效果,而给予中剂量（9.0 g/kg）和低剂量（6.0 g/kg）显示出了药效随剂量的降低而逐渐减弱的趋势,显示出了茵陈蒿汤治疗胆汁淤积药效的剂量依赖性。4.胆红素体外葡萄糖醛酸结合动力学结果显示在胆红素浓度为0.25-2.00μM时,UGT1A1孵育体系中总胆红素葡萄糖醛酸结合物（TBG）的生成动力学符合Hill方程;在胆红素浓度为0.25-2.00μM时,RLM孵育体系中TBG的生成动力学符合Michaelis-Menten方程。利用该孵育体系,研究了茵陈蒿汤有效成分、西药对胆红素体外葡萄糖醛酸结合的抑制作用,结果表明抑制剂阿扎那韦、索拉菲尼、埃罗替尼对胆红素葡萄糖醛酸结合抑制的IC₅₀分别为2.807、0.899、3.599μM,表现出了非常强的抑制作用;而茵陈蒿汤的入血有效成分京尼平,在浓度为100μM时,对胆红素葡萄糖醛酸结合的抑制率仅7.6%,认为京尼平对胆红素葡萄糖醛酸结合反应几乎没有抑制作用;而同样作为茵陈蒿汤的入血有效成分的大黄素,对胆红素葡萄糖醛酸结合的抑制的IC₅₀为25.745μM,表现出了较强的抑制作用。5.京尼平、大黄素利胆作用结果表明:灌胃40 mg/kg京尼平表现出了对胆汁淤积大鼠最为明显的治疗作用,其中大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、DBIL水平相比模型组分别降低了51.5%、39.4%、36.0%、26.7%、35.5%,6 h内的胆汁流速从0.36±0.21μL/min·100 g升高到了0.92±0.36μL/min·100g,且大鼠肝脏病理切片也显示肝细胞损伤情况也得到了明显的改善,对比于模型组,40 mg/kg的京尼平对胆汁淤积导致的代谢酶和转运子表达的减弱也有最大的改善作用,分别使UGT1A1、MRP2、OCT1、OATP1A4、NTCP、OATP1A1、MDR1、BSEP、OATP1A2水平增加了77.7%、103.2%、180.6%、123.5%、82.4%、41.1%、65.9%、66.2%和57.0%;60 mg/kg的京尼平和40 mg/kg的大黄素也可降低胆汁淤积大鼠的血清指标、增大胆汁流速、改善肝细胞损伤、增强代谢酶UGT1A1和部分转运子的表达,显示出了一定的治疗效果。结论:本研究证实了茵陈蒿汤对ANIT所致的大鼠胆汁淤积有较好的治疗效果,且其作用机制与其能增强肝脏中胆红素II相代谢酶UGT1A1和药物代谢转运子MRP2、OCT1、OATP1A4、NTCP、OATP1A1、MDR1、BSEP、OATP1A2的表达从而促进胆红素的代谢,以及改善肝细胞损伤有关。定量和定性研究结果表明,茵陈蒿汤主要成分有栀子苷、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯乙酮、大黄素、大黄酸等,这些成分在大鼠体内主要发生II相代谢,并检测到了大黄酸的葡萄糖醛酸结合物、对羟基苯乙酮的硫酸结合物,以及京尼平、大黄酸、大黄素、咖啡酸的葡萄糖醛酸和硫酸结合物,药代动力学行为显示,在胆汁淤积大鼠体内京尼平苷酸、栀子苷、京尼平II相代谢物的排泄减弱,而大黄素在进入大鼠体内后可迅速的发生II相代谢,其II相代谢物在胆汁淤积大鼠体内吸收程度降低、吸收速率增大、作用时间延长,结合大黄素和京尼平对胆红素体外葡萄糖醛酸代谢影响的研究结果（大黄素对胆红素体外葡萄糖醛酸结合抑制作用较强,京尼平对胆红素体外葡萄糖醛酸结合几乎没有抑制作用）以及这两种成分对胆汁淤积的药效,证实了大黄素可能直接作用于UGT1A1,诱导机体UGT1A1表达增强,并能提高转运子MRP2、NTCP、OCT1、OATP1A4的表达,促进胆红素的代谢最终改善胆汁淤积症状,而京尼平对UGT1A1表达的增强可能是间接调控的结果,并其也能提高转运子MRP2、NTCP、OCT1、OATP1A1、OATP1A2、OATP1A4、MDR1、BSEP的表达,发挥促进胆红素代谢从而治疗胆汁淤积的药效。