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衣原体属家族是专性胞内寄生的革兰氏阴性菌,具有特殊的双相发育周期:具有传染性但无代谢活性的原体（EB）进入宿主细胞,并在其中分化为具有代谢活性的网状体（RB）。目前衣原体主要有三种:鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体。本文探究主要针对沙眼衣原体,沙眼衣原体有15个血清型,严重威胁人类健康,感染人多为隐性感染。血清型A-C是导致沙眼和可预防性失明的主要原因。目前虽然我国不是沙眼疫区,但在我国一些贫困地区和国外的非洲地区,其仍然大量传播。血清型D-K主要引起泌尿生殖道的急性和慢性炎症性疾病,可导致不孕或异位妊娠[1]。LGV1-3感染会引起腹股沟淋巴结[2]。沙眼衣原体感染多为隐性感染,若不及时治疗极易引起反复感染,大大提高宫颈癌发病率和HIV的感染风险[3],同时引起盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎和尿道炎等多种并发症。[4,5]研究发现染色体CT135基因在沙眼衣原体中是一个重要的毒力因子[6],且沙眼衣原体质粒和包涵膜蛋白CT135是雌性小鼠生殖道感染发病机制中的毒力因子。当CT135基因发生无义突变时降低了沙眼衣原体的感染性和毒力[7]。目前尚无其蛋白功能研究的报道,功能研究亟待解决。第一章中,以p ET-32a（+）质粒为骨架,通过PCR扩增、无缝连接的实验技术连接,构建重组质粒WT-NS、WT-CS。考马斯亮蓝染色结果显示,两个重组蛋白都检测不到目的条带,结果提示CT135蛋白在大肠杆菌中表达量低。Western blotting结果显示,两个重组质粒均可表达重组蛋白,C端加有Strep-TagⅡ标签的重组质粒转入表达感受态后成功表达出CT135蛋白,蛋白大小为实际蛋白大小相符,且蛋白表达量随时间先增加后减少;而N端加有Strep-TagⅡ标签的重组质粒转入表达感受态后未检测到目的蛋白。另外做了m RNA的转录,进一步分析融合蛋白是否表达。结果提示N端和C端带有Strep-Tag II标签的重组质粒在大肠杆菌中都有RNA的转录,进而提示二者都有蛋白表达,且RNA水平随时间增加先增加后降低,这也与蛋白表达过程中蛋白量趋于稳定值的结果吻合。上述N端有Strep-Tag II标签的重组质粒一直无法检测到目的蛋白,想要探究具体原因,所以又考虑加构建GST标签的重组质粒。蛋白表达结果显示CT135没有移码时有融合蛋白的表达且大小为66×103左右,当CT135基因发生移码突变时,检测到目的蛋白大小为26×103左右,与实际大小相符,提示了蛋白可以正常表达。蛋白纯化结果显示,CT135蛋白不能大量纯化,究其原因主要是其表达量特别低,具体原因有待进一步探究。GST标签的两个重组质粒都检测到蛋白表达,证实了CT135蛋白编辑过程中N端没有被剪切,N端Strep-Tag II标签时检测不到目的蛋白很可能是标签太小被掩盖无法检测到。RNA结果提示CT135蛋白可能会影响自身RNA转录和自身蛋白翻译。第二章中,构建重组质粒,利用原核系统在大肠杆菌中表达CT135蛋白,首先以p ET-32a（+）质粒为载体,通过Nde I/Xho I双酶切,构建在CT135碳端含有His标签的重组质粒,并以此为基础,构建了氮端逐渐缩短的重组质粒MT1、MT2、MT3和碳端逐渐缩短的重组质粒MT4、MT5、MT6。蛋白表达结果显示,所有重组蛋白都能表达,但是表达量和表达量随时间变化情况都有所不同。WT蛋白大小为40×103,与实际蛋白大小相符,且蛋白表达量随时间先增加后减少,4～5h以后表达量接近本底水平,提示CT135蛋白表达量低且不稳定。而MT1～MT6截短突变体的小蛋白表达量随时间出现不同的变化趋势。其中MT1、MT2、MT4和MT5结果类似,蛋白表达量随着诱导时间增加几乎不变;MT3和MT6蛋白表达量随着时间增加而增加,二者不同的是后者表达量远远大于前者,于是选择MT6蛋白的大量纯化,用制备小鼠抗体。但由于MT6只是一个小蛋白,我们后续实验需要的是全长的CT135蛋白,所以制备出抗体后没有继续进行后续实验,将其分装冻存,进行后续研究。第三章主要是完成第二章中对CT135蛋白是否有毒性的一个初步验证。第二章中,目的蛋白在大肠杆菌中总是不能大量表达,我们怀疑是否当此蛋白大量表达时,就会对累积毒性杀死大肠杆菌或者抑制其生长。所以我们在第二章质粒的基础上构建了Lac I基因移码突变的重组质粒,并进行了涂板,观察结果。结果显示转化BL21（DE3）菌液涂板后空载体对照长势良好,而Lac I基因移码突变后的质粒转化涂板后几乎不长菌落或者只长少许菌落,与Lac I基因正常的板子相比菌落大量减少,结果提示CT135蛋白是有毒性的,且小片段蛋白也有毒性,初步验证了我们的推测,提示在原核细胞中CT135基因确实表达了一个毒性蛋白。第四章主要研究了在真核系统中CT135蛋白的表达情况,首先以pc DNA3.1（-）为载体,构建了含有RFP和CT135基因的七个穿梭质粒GWT、GMT1、GMT2、GMT3、GMT4、GMT5、GMT6,在大肠杆菌中大量制备,而后转染Vero细胞,通过WB和IFA实验观察CT135蛋白的表达情况。结果显示真核系统中,间接免疫荧光检测CT135蛋白能够表达,但不同的片段表达的小蛋白定位不同。不同小蛋白的不同定位为后续进一步研究其功能奠定基础。