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青叶胆是一味传统中药材,来源于龙胆科獐牙菜属植物青叶胆(Swertia mileensis T.N.Ho et W.L.Shi),对于黄疸型肝炎有显著疗效;其主要有效成分为獐牙菜苦苷,有着良好的保肝、利胆作用。青叶胆药材主要依赖于野生资源,近年来大规模无节制的采挖,使得青叶胆野生资源数目锐减,难以满足市场需求。通过探讨青叶胆中獐牙菜苦苷生物合成的遗传基础,找到獐牙菜苦苷生物合成的关键酶基因,能够为体外生物合成獐牙菜苦苷奠定基础。本研究利用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术,对青叶胆进行转录组测序,筛选得到与獐牙菜苦苷生物合成相关候选基因(GPPS-1、GPPS-2、GES、G10H-1、G10H-2、IS、DL7H-1、DL7H-2、SLS),探讨了候选基因的表达量与獐牙菜苦苷的关系,克隆得到了与獐牙菜苦苷生物合成显著正相关的关键酶基因。具体研究结果如下:对青叶胆全株进行了Illumina Hiseq 2500高通量测序后,经过数据拼接、组装后共得到68,643条Unigenes,平均长度为901 bp;共有42,954条Unigenes注释到NR,SwissProt,COG,KOG,GO,Pfam数据库中;在青叶胆獐牙菜苦苷生物合成的三个阶段中,有43条Unigenes参与中间体的生成,11条Unigenes参与萜类骨架构建,17条Unigenes参与萜类最后的修饰,搜索得到了参与骨架构建和后修饰的9个候选基因:GPPS-1、GPPS-2、GES、G10H-1、G10H-2、IS、DL7H-1、DL7H-2、SLS。采用实时荧光定量PCR技术分别测定了野生青叶胆不同发育时期(苗期、花期、果期)候选基因的表达量,结果表明GPPS-1、GPPS-2、GES、G10H-1、G10H-2、IS、DL7H-1和DL7H-2的表达模式相似,均为果期表达量最高,苗期最低;SLS则不同,表达量最高的是花期,最低的是苗期。采用高效液相色谱法测定了野生青叶胆苗期、花期、果期獐牙菜苦苷的含量,结果显示花期时獐牙菜苦苷含量相对最高。采用SPSS 19.0软件分析了候选基因的相对表达量与獐牙菜苦苷含量的相关性,分析显示GPPS-1、GPPS-2、GES、G10H-1、G10H-2、IS、DL7H-1、DL7H-2、SLS的表达量与獐牙菜苦苷的积累不具有显著相关性。采用实时荧光定量PCR和高效液相色谱法,测定了在茉莉酸甲酯处理下,青叶胆试管苗候选基因表达量与獐牙菜苦苷含量的变化,结果表明:MeJA对于GPPS-1和GPPS-2的作用不明显,但可以提高GES、G10H-1、G10H-2、IS、DL7H-1和DL7H-2的表达量,在一定程度上也能够影响SLS的表达量;在处理48 h时獐牙菜苦苷含量最高。相关性分析显示G10H-2和DL7H-1的表达量与獐牙菜苦苷含量之间存在显著正相关(P<0.05),可能是獐牙菜苦苷生物合成途径中的关键酶基因。采用RT-PCR技术克隆得到DL7H-1基因,序列全长962 bp,开放阅读框长948 bp,编码315个氨基酸,属于细胞色素P450超基因家族,与小蔓长春花(Vinca minor L.)的DL7H基因有较高的同源性。