研究背景龋病是口腔医学领域的常见病、多发病,是导致牙齿缺失的主要原因之一。龋病破坏咀嚼器官完整性,严重影响患者的消化功能、美观、心理健康及全身健康。龋病是在以细菌为主的多种因素影响下,牙体硬组织发生慢性进行性破坏的疾病。龋病过程中,细菌及其分泌的物质沿牙本质小管向牙髓组织入侵,修复性牙本质作为牙髓组织的保护屏障而形成,抵御外界细菌的入侵和刺激。牙髓组织中具有分化潜能的未分化间充质细胞为牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)。牙髓干细胞受到外界刺激后分化为成牙本质细胞并分泌形成修复性牙本质从而保护牙髓的过程被认为是牙髓组织参与的天然免疫反应过程。天然免疫反应是人体抵御病原体入侵和组织损伤的第一道生物屏障。人类的天然免疫反应是通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)特异性识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)来实现的。Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)是人类发现的第一个Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)家族成员,属于PRRs的一种,可以与PAMPs特异性结合,引起人体的天然免疫反应,抵抗病原体的侵犯,在人类的天然免疫反应过程中起重要作用。细胞的生物学特性：增殖、迁移和分化是组织修复的重要因素。目前已有研究报道,TLRs的激动剂可以引起细胞的迁移、侵袭并释放大量免疫调节因子。革兰氏阴性菌胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激成牙本质细胞后可以促进细胞的迁移能力。当牙乳头细胞中的TLR4被LPS激活后,可以释放大量的细胞因子如IL-1β, IL-6及IL-8。同样,纤维细胞受到LPS刺激后IL-1、CCL7、CCL26和CXCL11的分泌量增加。LPS可以抑制牙乳头干细胞成骨能力。这些报道提示,TLR4可能在牙髓组织的修复和再生过程中起重要作用。目前,关于TLR4在牙髓干细胞天然免疫反应中的作用机制并不明确。本课题比较了健康和深龋牙髓组织中TLR4的定位表达。观察TLR4被激活和抑制表达后对牙髓干细胞增殖、迁移、矿化能力的调控作用。旨在明确TLR4在牙髓天然免疫反应中的作用。本论文主要包括以下五章内容：第一章TLR4在人健康和深龋牙髓组织中的定位表达本章实验主要采用脱矿后HE染色,免疫组织化学染色及免疫荧光染色的方法,比较TLR4在健康和深龋牙髓组织中的定位表达。材料与方法(一)HE染色随机抽取临床上18-26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿以及深龋但无牙髓炎症状的牙齿各3例(经患者本人及家属知情同意)。拔除前彻底消毒,拔出后即刻放入10%福尔马林固定液中储存。EDTA联合微波超声脱矿法在10%EDTA溶液中脱矿4周后进行脱水、透明及包埋处理。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水,经苏木精染色、伊红染色后脱水、透明、封片,正置显微镜下观察牙齿组织形态。(二)牙髓组织免疫化学染色取临床上18-26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿(8例)以及深龋但无牙髓炎症状的牙齿(12例)(经患者本人及家属知情同意)。拔除前彻底消毒,拔出后即刻放入10%福尔马林固定液中储存。标本沿釉牙骨质界用高速手机环绕牙颈部磨出2mm深度的沟槽,将牙齿沿沟槽劈开,取出牙髓,放入包埋盒内,标记后进行脱水、透明、包埋及切片处理。石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,3%H2O2灭活过氧化物酶,山羊血清孵育30min, TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃孵育过夜。PBS洗3次,兔抗鼠二抗(1：500)室温孵育1h, PBS冲洗3次。DAB显色液染色2min,镜下观察,见标本出现棕褐色特异性染色时终止染色。蒸馏水充分冲洗,苏木素复染,中性树胶封片,正置显微镜观察、拍照。(三)牙髓组织免疫荧光染色标本同牙髓免疫组织化学染色。石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,3%H2O2灭活过氧化物酶,山羊血清孵育30min。TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃孵育过夜,PBS洗3次。FITC标记的兔抗鼠二抗(1：500)室温避光孵育1h,PBS冲洗3次,防淬灭封片剂封片,正置荧光显微镜观察、拍照。结果(一)HE染色结果显示,深龋牙齿牙本质中牙本质小管被破坏并存在大量细菌团块,但牙髓组织与健康牙髓组织相比未见明显变化。(二)免疫组织化学染色及免疫荧光染色TLR4主要分布于牙髓组织的成牙本质细胞层及血管周围组织,且深龋牙髓中TLR4阳性染色较正常牙髓组织增多。提示TLR4可能参与了深龋牙髓的天然免疫反应。第二章人牙髓干细胞的体外培养和鉴定本章实验主要采用组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,并从细胞表面标记物分析、形态学观察、生长曲线及多向分化能力等方面对所培养的细胞进行鉴定,为后续实验提供稳定可靠的细胞来源。材料与方法(一)人牙髓干细胞的分离培养取临床上18-26岁健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、无龋坏的牙齿30例(经患者本人及家属知情同意)。拔除前彻底消毒,拔出后沿釉牙骨质界用高速手机环绕牙颈部磨出2mm深度的沟槽,即刻放入预冷的含有1%双抗的不完全培养基中储存。在超净台内将牙齿从培养基中取出,用含双抗的PBS冲洗3遍,将牙齿沿沟槽劈开,取出牙髓,去除根尖2mm的牙髓,置于PBS缓冲液内反复漂洗至少3次。用眼科剪将牙髓组织剪成约0.5mm3大小的小块,用Ⅰ型胶原酶(3mg/mL)37℃消化组织块10min,加入完全培养基终止消化,1000r/min离心3min,弃上清,加入少量完全培养基,混匀后将悬浊液接种至6孔板内,将盖玻片压于组织之上,补充适量液体。放入C02孵箱内37℃培养,一天后换液,以后每3d换液,倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞游出并达到70%-80%汇合时以0.25%胰酶消化,按1：2传代。3-5代细胞用于后续实验。(二)流式细胞术检测牙髓干细胞表面标记物取第3代处于对数生长期的牙髓干细胞,调整细胞密度至1×105-5×105/mL。用CD29、CD34、CD45、CD90、CD44、CD106抗体冰上避光敷育细胞1h,PBS漂洗2遍,加入1mL固定液。吹匀细胞后流式细胞仪检测细胞表面标记物。(三)多向分化能力检测取处于对数生长期的第3代牙髓干细胞,以2×105/孔细胞接种于六孔板中,待细胞生长达到80%融合时,更换成骨、成软骨及成脂诱导培养液,将牙髓干细胞向成骨、成软骨及脂肪方向诱导分化。诱导液培养21d后,分别用茜素红、阿新蓝、油红O染色,倒置显微镜下观察并拍照。(四)细胞计数法绘制细胞生长曲线取处于对数生长期的第3代细胞,以1×104/孔L的密度接种于24孔板。分别于培养的1d、3d、5d、7d用细胞计数仪进行活细胞计数,每组3个复孔。实验重复3次,求均值。记录每次细胞数量,绘制牙髓干细胞的生长曲线。(五)MTT法绘制细胞生长曲线取处于对数生长期的第3代细胞,以3×103/孔的密度接种于96孔板,分别于培养的Id、3d、5d、7d进行MTT检测。检测时每孔加入MTT液20μL,37℃继续孵育4h,用细针头轻轻吸去培养液。每孔加入150μL DMSO,微振荡10min,使结晶物充分溶解。选择490nm波长,用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值,求均值。实验重复3次。绘制牙髓干细胞的生长曲线。(六)统计分析实验结果用SPSS13.0统计软件处理,数据以x±s表示。结果(一)牙髓干细胞的原代培养组织块经酶消化后变的疏松并可发现部分游离的单个细胞,接种后3-5d便有细胞自组织块游出,7-10d可以传代。细胞呈梭形,胞质透光性好。(二)细胞表面标记物分析流式细胞仪检测牙髓干细胞表面标记物。结果显示,细胞表达间充质干细胞表面标记物CD29、CD44、CD90呈阳性,表达率分别为99.26%、95.17%和99.68%；表达造血干细胞表面标记物CD34、CD45、CD106呈阴性,表达率分别为0.1%、0.33%和0.32%。说明培养的细胞为间充质来源。(三)细胞多向分化能力细胞经矿化诱导液培养21d后,细胞数量迅速增加,呈复层生长,细胞极性发生变化,部分区域细胞聚集成团。茜素红染色可见大小不等的红褐色矿化结节分散分布于培养皿中。经成软骨诱导液培养21d后,有半透明状细胞团形成,阿新蓝染色后可见蓝染区。经成脂诱导21d后,脂滴逐渐融合变大,油红O染色后可见橘红色脂滴分布于细胞质中。(四)生长曲线细胞计数法及MTT法绘制牙髓干细胞生长曲线。两种方法绘制的生长曲线均成“S”形。细胞于接种后3d进入对数生长期,5d后进入平台期。细胞生长状态良好。第三章脂多糖与变形链球菌刺激下TLR4在牙髓干细胞中的表达本章实验采用LPS及变形链球菌提取物对牙髓干细胞进行刺激,模拟深龋状态下牙髓的内环境。用RT-PCR技术、western blot和细胞免疫荧光检测TLR4表达变化。探讨LPS及变形链球菌提取物是否可以改变牙髓干细胞TLR4的表达。材料与方法(一)变形链球菌提取物的制备收集变形链球菌标准株UA159于离心管中,PBS洗菌2次。利用超声破碎仪破碎细菌,离心收集上清液。0.22μm滤器过滤上清液,蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度,用DMEM稀释细菌提取液至1mg/mL的储存浓度,分装后存放于-80℃保存备用。(二) RT-PCR1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物刺激牙髓干细胞后0h、12h、24h、48h收集细胞。Trizol抽提牙髓干细胞的总RNA,分光光度计检测RNA浓度,PrimeScriptR试剂盒将RNA逆转录成cDNA后采用SYBR法进行PCR扩增,所有基因通过7500RT-PCR仪进行检测后,用相对定量法计算2-△△CT值代表TLR4的相对表达强度。实验重复3次。(三)Western blot1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物刺激牙髓干细胞24h。蛋白裂解液抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、免疫杂交、显色。(四)细胞免疫荧光取处于对数生长期的3-5代牙髓干细胞,以3×103个细胞接种于玻片上。1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物刺激牙髓干细胞24h。4%的甲醛室温固定20min,0.2%Triton X-100透化,10%山羊血清封闭剂孵育10min, TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃C孵育过夜。PBS洗3次,FITC标记的兔抗鼠二抗(1：500)室温避光孵育1h, DAPI细胞核染色。防淬灭封片剂封片,正置荧光显微镜下观察、拍照。(五)统计分析实验结果用SPSS13.0统计软件处理,数据以x±s表示。RT-PCR检测LPS及变形链球菌提取物刺激后牙髓干细胞中TLR4mRNA的表达时采用单因素方差分析进行显著性分析,然后用Levene’s test检验方差齐性(检验水准α=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的Bonferroni检验,反之,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行分析后Dunnett’T3检验进行两两比较,检验水准a=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果(一)RT-PCR结果结果显示,与0h牙髓干细胞TLR4表达量相比,在LPS或变形链球菌提取物刺激后12h、24h、48h牙髓干细胞中TLR4mRNA的表达均有所增高。LPS刺激实验中,经过单因素方差统计分析,组间TLR4mRNA的表达量具有统计学意义(F=852.193,P=0.000)。变形链球菌提取物刺激实验中,经过单因素方差统计分析,组间TLR4mRNA的表达量具有统计学意义(F=1471.990,P=0.000),具有显著的统计学差异。(二)Western blot结果结果显示,LPS及变形链球菌提取物刺激组细胞的蛋白条带灰度明显高于空白对照组,说明牙髓干细胞受到以上两种刺激后TLR4蛋白表达增加。(三)细胞免疫荧光空白对照组牙髓干细胞中绿色荧光较弱,经LPS或变形链球菌刺激后牙髓干细胞中绿色荧光明显增强。第四章脂多糖与变形链球菌激活TLR4后牙髓干细胞生物学特性的改变本章实验讨论了LPS及变形链球菌提取物激活牙髓干细胞TLR4后对细胞增殖、迁移和矿化等细胞生物学特性的影响。实验运用MTT法、划痕试验、transwell实验、茜素红染色和RT-PCR技术检测了牙髓干细胞的增殖、迁移和矿化能力。材料与方法(一)MTT法绘制细胞生长曲线取处于对数生长期的第3-5代细胞,以3x103/孔的密度接种于96孔板。待细胞完全贴壁后,更换含有0.lμg/mL、1μg/mL、10μg/mL LPS或含有0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL变形链球菌提取物的完全培养基,空白对照组用普通完全培养基培养细胞。分别于培养的1d、3d、5d、7d进行MTT检测。检测时每孔加入MTT液20μL,37℃继续孵育4h,用细针头轻轻吸去上清培养液。每孔加入150μg DMSO,微振荡10min,使结晶物充分溶解。选择490nm波长,用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值,求均值。实验重复3次。绘制牙髓干细胞的生长曲线。(二)划痕试验取处于对数生长期的第3-5代牙髓干细胞,以1×105/孔的密度接种于6孔板,每组3个复孔。待细胞生长至90%汇合后,用小枪头沿尺子在六孔板底划1mm宽的划痕,并用倒置显微镜检测各观测点划痕宽度一致。更换含有1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物的无血清培养基,在刺激后0h,24h,48h对观测点进行拍照,观察细胞水平向迁移能力。(三)Transwell实验取处于对数生长期的第3-5代牙髓干细胞,以2×104／孔的密度接种于transwell上室,调整液体至200μL,下室内加入500μL含有10%FBS的完全培养液和1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物；细胞培养箱内迁移24h；弃transwell上、下室内液体,甲醇固定10min；1%结晶紫染色15min；棉签轻轻擦去transwell上室内侧未迁移的细胞；显微镜下随机选取5个200倍视野,读取细胞个数,并计算平均数；实验重复六次并进行统计学分析。(四)矿化结节染色取处于对数生长期的第3代牙髓干细胞,以2×105个细胞接种于六孔板中,待细胞生长达到80%融合时,更换含有1μg/mL LPS或1μg/mL变形链球菌提取物的成骨诱导培养液,对照组用普通成骨诱导液培养,将牙髓干细胞向成骨方向诱导分化。培养21d后,分别用茜素红染色,倒置显微镜下观察并拍照。(五)RT-PCR成骨诱导液培养21d后,RT-PCR检测矿化相关基因OCN、BSP、ALP的表达情况。Trizol抽提牙髓干细胞的总RNA,分光光度计检测RNA浓度,PrimeScriptR试剂盒将RNA逆转录成cDNA后采用SYBR法进行PCR扩增,所有基因通过7500RT-PCR仪进行检测后,用相对定量法计算2-△△CT值代表基因的相对表达强度。实验重复3次。(六)统计分析实验结果用SPSS13.0统计软件处理,数据以x±s表示。MTT实验采用析因设计的方差分析进行统计分析,组间进一步采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),然后用Levene’s test检验方差齐性(检验水准a=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的Bonferroni检验,反之,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行分析后Dunnett’T3检验进行两两比较；transwell实验、矿化结节量化比较和RT-PCR检测矿化相关基因采用单因素方差分析进行显著性分析,P<0.05为差异有统计学意义。用Levene’s test检验方差齐性(检验水准α=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的Bonferroni检验,反之,方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行分析后Dunnett’T3检验进行两两比较。检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果(一)牙髓干细胞增殖能力MTT法检测牙髓干细胞增殖能力,各时间点不同浓度LPS组与对照组相比均有较低的OD值,差异具有统计学意义(P<0.05)。在各时间点,与对照组相比,各浓度变形链球菌提取物组牙髓干细胞增殖能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)(二)牙髓干细胞迁移能力划痕试验显示,各浓度LPS和变形链球菌提取物可以促进细胞水平向迁移能力,transwell实验结果显示各浓度LPS可以显著增加细胞垂直向迁移数量(F=117.722,P=0.000)。变形链球菌提取物也可以促进牙髓干细胞移能力(F=142.676,P=0.000)。(三)牙髓干细胞矿化能力与对照组相比,LPS和变形链球菌提取物可以使牙髓干细胞矿化结节形成量减少(F=3369.577,P=0.000),矿化相关基因OCN (F=74.446, P=0.000), BSP (F=,417.217, P=0.000), ALP (F=60.861,P=0.000)表达量下调。第五章TLR4对牙髓干细胞生物学特性的调控作用本章实验主要讨论TLR4对牙髓干细胞生物学特性的调控作用。实验构建了抑制TLR4表达的慢病毒载体以抑制TLR4的表达,运用MTT法、transwell实验、茜素红染色和RT-PCR技术检测了牙髓干细胞的增殖、迁移和矿化能力。材料与方法(一)抑制TLR4慢病毒表达载体的构建及细胞感染Si-TLR4’慢病毒表达载体为pGLV3/Hl/GFP+Puro,包装系统为pGag/Pol、 pRev、pVSV-G,包装细胞：293T细胞。含目的序列的穿梭质粒和包装质粒共转染293T细胞,收集浓缩病毒,测定病毒滴度。将慢病毒悬液按照不同感染复数感染正常人牙髓干细胞,确定感染参数。(二)MTT法绘制细胞生长曲线牙髓干细胞转染抑制TLR4慢病毒表达载体及空载组慢病毒后,以3×103/孔的密度接种于96孔板。待细胞完全贴壁后,分别于培养的1d、3d、5d、7d进行MTT检测。检测时每孔加入MTT液20μL,37℃继续孵育4h,用细针头轻轻吸去上清培养液。每孔加入150μ L DMSO,微振荡10min,使结晶物充分溶解。选择490nm波长,用酶联免疫检测仪测定各孔光吸收值,求均值。实验重复3次。绘制牙髓干细胞的生长曲线。(三)Transwell实验牙髓干细胞转染抑制TLR4慢病毒表达载体及空载组慢病毒后,以2×104/孔的密度接种于transwell上室,调整液体至200μL,下室内加入500μL含有10%FBS的完全培养液；细胞培养箱内迁移24h；弃transwell上、下室内液体,甲醇固定10min；1%结晶紫染色15min；棉签轻轻擦去ranswell上室内侧未迁移的细胞；显微镜下随机选取5个200倍视野,读取细胞个数,并计算平均数；实验重复六次并进行统计学分析。(四)矿化结节染色牙髓干细胞转染抑制TLR4慢病毒表达载体及空载组慢病毒后,以2×105个细胞接种于六孔板中,待细胞生长达到80%融合时,更换成骨诱导培养液,将牙髓干细胞向成骨方向分化。诱导液培养21d后,分别用茜素红染色,倒置显微镜下观察并拍照。(五)RT-PCR成骨诱导液培养21d后,RT-PCR检测矿化相关基因OCN、BSP、ALP的表达情况。Trizol抽提牙髓干细胞的总RNA,分光光度计检测RNA浓度,PrimeScript试剂盒将RNA逆转录成cDNA后采用SYBR法进行PCR扩增,所有基因通过7500RT-PCR仪进行检测后,用相对定量法计算2-△△CT值代表基因的相对表达强度。实验重复3次。(六)统计分析实验结果用SPSS13.0统计软件处理,数据以x±s表示。转染抑制TLR4慢病毒表达载体后牙髓干细胞中TLR4表达情况的RT-PCR实验采用单因素方差分析进行统计学分析,用Levene’s test检验方差齐性(检验水准a=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的Bonferroni检验,反之,方差不齐,采用近似F检验的Welch方法进行分析后Dunnett’T3检验进行两两比较。MTT采用析因设计的方差分析确定是否存在交互效应,进一步组间比较采用单因素方差分析进行统计学分析。转染抑制TLR4慢病毒表达载体后的transwell实验、矿化结节形成比较和RT-PCR检测矿化相关基因的实验数据采用独立样本t检验进行统计学分析,检验水准α=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。结果(一)Si-TLR4慢病毒的稳定转染与检验实验构建了抑制TLR4慢病毒表达载体。转染牙髓干细胞后,通过RT-PCR检测证实TLR4mRNA表达量显著降低(F=196.427, P=0.000), western blot检测证明TLR4蛋白表达受到抑制。(二)牙髓干细胞的增殖能力MTT结果显示,抑制TLR4慢病毒表达载体转染牙髓干细胞后,第3d、5d和7d三个时间点Si-TLR4组细胞增值能力均低于对照组(P=0.000),具有统计学意义。可见抑制牙髓干细胞TLR4表达后,细胞增殖能力显著降低。(三)牙髓干细胞的迁移能力抑制TLR4慢病毒表达载体转染牙髓干细胞后,经transwell实验检测,与对照组相比,经过24h的细胞迁移,穿过transwell小室底膜的牙髓干细胞数量显著减少(t=12.734,P=0.000),说明抑制TLR4表达后牙髓干细胞迁移能力降低。(四)牙髓干细胞的矿化能力下调TLR4表达后,矿化基因OCN (t=-3.416, P=0.027), BSP(t=-12.344, P=0.000)、ALP (t=-55.815, P=0.000)表达量明显上调,矿化结节形成量增多(t=-56.160,P=0.000)。结论1.TLR4定位表达于牙髓成牙本质细胞层及血管周围组织,且深龋牙髓组织中TLR4表达量较正常牙髓组织增多。TLR4参与了牙髓组织的天然免疫反应。2.组织块酶消化法可以成功培养人牙髓干细胞,细胞为间充质来源,具有向成骨、成软骨及成脂方向分化的多向分化潜能,经鉴定确认为人牙髓干细胞。3.LPS和变形链球菌提取物可以激活人牙髓干细胞中TLR4的表达,并且对牙髓干细胞的增殖能力和矿化能力有抑制作用,对牙髓干细胞迁移能力起促进作用。4.抑制TLR4表达后,可显著下调牙髓干细胞增殖能力、迁移能力,促进牙髓干细胞矿化能力。TLR4对牙髓干细胞的生物学特性具有调控作用。