艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥叶，分布于我国大部分地区，资源丰富，拥有两千多年的药用历史，古书记载其有温经止血、散寒止痛之功效，为《药典》收载品种[1,2]。近代以来，对于艾叶的药理作用及化学成分的研究进展迅速。主要化学成分包括挥发油、甾醇类、萜类、黄酮类、香豆素类和微量元素等[3~6]。现代实验研究表明艾叶具有平喘镇咳、祛痰止血、抗菌抗病毒、增强免疫、护肝利胆及补体激活等作用[7~10]，而关于艾叶抗HBV活性的研究尚未见报道。　　本课题组前期经体内、外实验研究首次发现艾叶挥发油和乙酸乙酯提取物具有抗HBV活性[11,12]，相关研究内容获国家发明专利授权2项。为研究艾叶抗HBV有效部位新药，进一步确定有效位、明确药效物质基础，本文在前期研究的基础上，对艾叶乙酸乙酯提取物四个不同极性部位按大类成分进一步分离、纯化，所得各组分进行抗HBV活性筛选，并对活性较好组分作初步成分分析。　　1.艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位制备及系统预试验。将5Kg艾叶粉碎，首先用水蒸气蒸馏法提取挥发油，然后依次以石油醚（30~60℃）、乙酸乙酯回流提取得到乙酸乙酯浸膏共129.2g，乙酸乙酯浸膏再依次以石油醚（60~90℃）、石油醚-乙酸乙酯（1:1）、60％乙醇回流提取，及滤渣（乙酸乙酯部位）共得到四个不同极性部位 EA-1（62.1g）、EA-2(46.8g)、EA-3(5.2g)和 EA-4(10.2g)。采用系统预试验的方法对各部位进行分析，实验表明：EA-1以甾体三萜类为主，EA-2和EA-3以香豆素和黄酮类为主，EA-4以极性较大的甾萜类为主。　　2. EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的分离纯化及所得组分的定性分析。采用硅胶柱层析和制备薄层色谱法分别对EA-1、EA-2、EA-3和EA-4进行分类分离、纯化和富集。其中EA-1得到10个组分，分别为：EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S5、EA-S11、EA-S12、EA-S21、EA-S31、EA-S32和EA-S51；EA-2得到4个组分，分别为：EA-S4、EA-S41、EA-F1和EA-F2；EA-3和EA-4得到2个组分，分别为EA-S6和EA-M。将EA-1和EA-2柱层析D段流分及EA-3和EA-4柱层析B段流分合并，通过制备薄层色谱法，分离纯化得到组分 EA-C1和 EA-C2。以上共得到18个组分。EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S5、EA-S6、EA-F1、EA-F2、EA-C1和EA-C2系统预试验结果显示：EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S4、EA-S5和EA-S6以甾体三萜类为主，EA-C1和EA-C2为香豆素类，EA-F1和EA-F2为黄酮类。其中通过TLC法比对，EA-F1与前期确定结构的20120313F为同一化合物即5,4'-二羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(3'-甲氧基蓟黄素)，EA-F2为前期确定结构的化合物20120313F和20130430B的混合物，即5,4'-二羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(3'-甲氧基蓟黄素)和5,7,4'－三羟基－3',8－二甲氧基黄酮的混合物。　　3.各组分抗HBV体外活性筛选实验。建立HepG2.2.15细胞模型，采用MTT法检测各组分对 HepG2.2.15细胞的毒性作用，采用 ELISA法检测各组分对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg分泌的影响。结果显示： EA-S1、EA-S21、EA-S41和EA-S51半数毒性浓度（TC50）均大于800μg·mL-1，相较于课题组前期未做分离纯化的EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的半数毒性浓度更大，毒性更低；EA-S1、EA-S2、EA-S4、EA-S21、EA-S32和EA-S41对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用相对较明显，并呈剂量依赖性，其中EA-S1对HBsAg的半数抑制浓度（IC50）为8.09μg·mL-1，EA-S2对HBsAg的半数抑制浓度为7.38μg·mL-1，EA-S4对 HBeAg的半数抑制浓度为7.39μg·mL-1，EA-S21对 HBsAg和 HBeAg的半数抑制浓度分别为3.42μg·mL-1和小于2.5μg·mL-1， EA-S41对HBsAg的半数抑制浓度为7.65μg·mL-1；给药第9天EA-S1对HBsAg的治疗指数（TI）大于98.9，EA-S21对HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为234.7和大于321.1，EA-S32对HBeAg的治疗指数大于63.4，EA-41对HBsAg的治疗指数大于104.6。综合上述结果，EA-S1、EA-S21和EA-41的抗HBV活性较好。　　4.组分EA-S1、EA-S41和EA-S21成分分析。采用硅胶柱层析和重结晶方法对EA-S1、EA-S41和 EA-S21分别进行分离纯化，从 EA-S1中分离得到三个单体化合物 FAA20150316A、FAA20150322A和 FAA20150319A，从 EA-S41中分离得到一个单体化合物 FAA20150319B，从 EA-S21中分离得到一个单体化合物FAA20150323A。TLC法鉴定显示FAA20150322A与FAA20150319A为同一化合物，FAA20150323A与FAA20150316A和FAA20150319B为同一化合物，且FAA20150319A、FAA20150322A、FAA20150316A和FAA20150319B的纯度均大于99%。运用核磁共振波谱法、质谱法及参考相关文献对 FAA20150319B和FAA20150322A进行结构鉴定，分别为十六烷酸丙酯和正三十一烷。　　本文首次对艾叶乙酸乙酯提取物所含大类成分进行了纯化富集，得到18个组分，并进行了抗HBV体外活性筛选，从中得到了抗HBV活性较好的EA-S1、EA-S21和EA-S41，并对其进行了初步的成分分析，为进一步体内抗HBV活性研究奠定了基础，并为最终研发艾叶抗HBV有效部位新药提供了依据。