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艾叶为菊科植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥叶,分布于我国大部分地区,资源丰富,拥有两千多年的药用历史,古书记载其有温经止血、散寒止痛之功效,为《药典》收载品种[1,2]。近代以来,对于艾叶的药理作用及化学成分的研究进展迅速。主要化学成分包括挥发油、甾醇类、萜类、黄酮类、香豆素类和微量元素等[3~6]。现代实验研究表明艾叶具有平喘镇咳、祛痰止血、抗菌抗病毒、增强免疫、护肝利胆及补体激活等作用[7~10],而关于艾叶抗HBV活性的研究尚未见报道。 本课题组前期经体内、外实验研究首次发现艾叶挥发油和乙酸乙酯提取物具有抗HBV活性[11,12],相关研究内容获国家发明专利授权2项。为研究艾叶抗HBV有效部位新药,进一步确定有效位、明确药效物质基础,本文在前期研究的基础上,对艾叶乙酸乙酯提取物四个不同极性部位按大类成分进一步分离、纯化,所得各组分进行抗HBV活性筛选,并对活性较好组分作初步成分分析。 1.艾叶乙酸乙酯提取物不同极性部位制备及系统预试验。将5Kg艾叶粉碎,首先用水蒸气蒸馏法提取挥发油,然后依次以石油醚(30~60℃)、乙酸乙酯回流提取得到乙酸乙酯浸膏共129.2g,乙酸乙酯浸膏再依次以石油醚(60~90℃)、石油醚-乙酸乙酯(1:1)、60%乙醇回流提取,及滤渣(乙酸乙酯部位)共得到四个不同极性部位 EA-1(62.1g)、EA-2(46.8g)、EA-3(5.2g)和 EA-4(10.2g)。采用系统预试验的方法对各部位进行分析,实验表明:EA-1以甾体三萜类为主,EA-2和EA-3以香豆素和黄酮类为主,EA-4以极性较大的甾萜类为主。 2. EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的分离纯化及所得组分的定性分析。采用硅胶柱层析和制备薄层色谱法分别对EA-1、EA-2、EA-3和EA-4进行分类分离、纯化和富集。其中EA-1得到10个组分,分别为:EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S5、EA-S11、EA-S12、EA-S21、EA-S31、EA-S32和EA-S51;EA-2得到4个组分,分别为:EA-S4、EA-S41、EA-F1和EA-F2;EA-3和EA-4得到2个组分,分别为EA-S6和EA-M。将EA-1和EA-2柱层析D段流分及EA-3和EA-4柱层析B段流分合并,通过制备薄层色谱法,分离纯化得到组分 EA-C1和 EA-C2。以上共得到18个组分。EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S5、EA-S6、EA-F1、EA-F2、EA-C1和EA-C2系统预试验结果显示:EA-S1、EA-S2、EA-S3、EA-S4、EA-S5和EA-S6以甾体三萜类为主,EA-C1和EA-C2为香豆素类,EA-F1和EA-F2为黄酮类。其中通过TLC法比对,EA-F1与前期确定结构的20120313F为同一化合物即5,4'-二羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(3'-甲氧基蓟黄素),EA-F2为前期确定结构的化合物20120313F和20130430B的混合物,即5,4'-二羟基-6,7,3'-三甲氧基黄酮(3'-甲氧基蓟黄素)和5,7,4'-三羟基-3',8-二甲氧基黄酮的混合物。 3.各组分抗HBV体外活性筛选实验。建立HepG2.2.15细胞模型,采用MTT法检测各组分对 HepG2.2.15细胞的毒性作用,采用 ELISA法检测各组分对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg分泌的影响。结果显示: EA-S1、EA-S21、EA-S41和EA-S51半数毒性浓度(TC50)均大于800μg·mL-1,相较于课题组前期未做分离纯化的EA-1、EA-2、EA-3和EA-4的半数毒性浓度更大,毒性更低;EA-S1、EA-S2、EA-S4、EA-S21、EA-S32和EA-S41对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用相对较明显,并呈剂量依赖性,其中EA-S1对HBsAg的半数抑制浓度(IC50)为8.09μg·mL-1,EA-S2对HBsAg的半数抑制浓度为7.38μg·mL-1,EA-S4对 HBeAg的半数抑制浓度为7.39μg·mL-1,EA-S21对 HBsAg和 HBeAg的半数抑制浓度分别为3.42μg·mL-1和小于2.5μg·mL-1, EA-S41对HBsAg的半数抑制浓度为7.65μg·mL-1;给药第9天EA-S1对HBsAg的治疗指数(TI)大于98.9,EA-S21对HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为234.7和大于321.1,EA-S32对HBeAg的治疗指数大于63.4,EA-41对HBsAg的治疗指数大于104.6。综合上述结果,EA-S1、EA-S21和EA-41的抗HBV活性较好。 4.组分EA-S1、EA-S41和EA-S21成分分析。采用硅胶柱层析和重结晶方法对EA-S1、EA-S41和 EA-S21分别进行分离纯化,从 EA-S1中分离得到三个单体化合物 FAA20150316A、FAA20150322A和 FAA20150319A,从 EA-S41中分离得到一个单体化合物 FAA20150319B,从 EA-S21中分离得到一个单体化合物FAA20150323A。TLC法鉴定显示FAA20150322A与FAA20150319A为同一化合物,FAA20150323A与FAA20150316A和FAA20150319B为同一化合物,且FAA20150319A、FAA20150322A、FAA20150316A和FAA20150319B的纯度均大于99%。运用核磁共振波谱法、质谱法及参考相关文献对 FAA20150319B和FAA20150322A进行结构鉴定,分别为十六烷酸丙酯和正三十一烷。 本文首次对艾叶乙酸乙酯提取物所含大类成分进行了纯化富集,得到18个组分,并进行了抗HBV体外活性筛选,从中得到了抗HBV活性较好的EA-S1、EA-S21和EA-S41,并对其进行了初步的成分分析,为进一步体内抗HBV活性研究奠定了基础,并为最终研发艾叶抗HBV有效部位新药提供了依据。