大多数化疗药物通过凋亡依赖的方式发挥其抗肿瘤活性。然而,除了药物的毒副作用外,复发性肿瘤患者产生的化疗药物耐受、多药耐药现象普遍,严重制约药物的治疗效果。尽管药物耐受的机制有很多深入细致的研究,但因其机制复杂,各种信号通路、蛋白因子交互参与,其逆转药物的研究一直倍受关注。研究发现,肿瘤细胞为维持自身的快速增殖,某些信号、蛋白合成与降解途径等存在缺陷,也是耐药的机制之一,如肿瘤细胞的凋亡机制存在异常,诱导凋亡蛋白突变、缺失等对凋亡诱导剂不敏感,产生化疗耐受。因此,通过诱导肿瘤细胞以凋亡非依赖的方式死亡可能为凋亡抵抗相关的多药耐药恶性肿瘤的治疗提供一种有效的策略和思路,相关的诱导剂研究日益增多,并证实激活非凋亡式细胞死亡或同时存在的凋亡积累可增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。凋亡非依赖性细胞死亡的机制已有多种,如旁凋亡、自噬性细胞死亡、坏死性细胞凋亡、巨泡性细胞死亡等。其中旁凋亡、自噬性细胞死亡多有出泡现象伴随,称之为出泡性细胞死亡。旁凋亡是非凋亡性细胞死亡的形式之一,其特点为caspase非依赖并缺乏凋亡性细胞死亡的形态,细胞质内肿胀的内质网和／或线粒体产生大量空泡。虽然引起内质网和／或线粒体扩张的相关机制尚不明确,但是有研究发现蛋白质的从头合成与内质网应激在旁凋亡过程中扮演重要角色,因为抑制蛋白的合成可以减弱空泡化现象。内质网应激还可通过引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)导致细胞死亡,其主要通过三条内质网传感通路：双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(1protein kinase RNA like ER kinase,PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor-6, ATF6)及肌醇需求酶1 (inositol requiring protein-1, IRE 1)。自噬性细胞死亡发生时,细胞胞浆产生大量游离的膜状结构使细胞内出现“泡”状结构,随之形成双层膜结构的空泡,其内部主要为“废弃”细胞器甚至含有部分细胞浆,称为自噬泡(Autophagosome)。就目前的研究进展,自噬泡起源尚不清楚,有人认为来自于细胞内膜性细胞器,如粗面内质网,高尔基体及其膜囊泡体等,也有人认为这些膜状结构是重新合成的。在哺乳动物中,自噬泡的起始过程主要由Atg蛋白家族成员介导,在自噬形成过程中伴随LC3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)的参与。结果：第一部分天然化合物诱导肿瘤细胞死亡的活性筛选1.苯并喹诺里西啶类化合物诱导肿瘤细胞空泡样死亡本论文首先利用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231,MCF-7),人宫颈癌细胞(Hela),人慢性髓原白血病细胞(K562),人前列腺癌细胞(PC3, DU145)和人正常前列腺上皮细胞(RWPE1)为筛选模型,对35种苯并喹诺里西啶类化合物进行了活性筛选。发现苯并喹诺里西啶类化合物具有良好的抗肿瘤活性,对其中活性较高的化合物进行复筛,观察其诱导细胞胞浆产生的空泡化现象。2.双联苄类衍生物协同蛋白酶体抑制剂MG132诱导肿瘤细胞空泡样死亡前期研究发现,双联苄类化合物中,地钱素C (Marchantin C,MC)在体内外具有一定抗肿瘤活性,同时可以诱导肿瘤细胞旁凋亡性细胞死亡。本论文中,我们进一步将地钱素C与MG132联用,发现在诱导肿瘤细胞胞浆空泡和死亡方面二者具有协同作用。第二部分化合物22b诱导肿瘤细胞旁凋亡的机制研究前期对新型苯并喹诺里西啶类衍生物的抗肿瘤活性筛选结果表明,此类生物碱作为抗肿瘤化合物,具有同时诱导肿瘤细胞凋亡和旁凋亡两种死亡途径的特征,对于化疗抵抗的抗肿瘤治疗有一定优势,存在巨大的研究潜力,从中选出化合物22b为代表化合物,前列腺癌(Prostate cancer, PCa)细胞为模型进行凋亡非依赖性死亡的机制研究。1.化合物22b引起肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和空泡化现象我们利用流式细胞技术分析了化合物22b对PCa的细胞周期及凋亡的影响,结果显示,化合物22b可将细胞阻滞于G0/G1期,同时引起浓度依赖的一定程度的细胞凋亡。但是泛硫胱胺酸蛋白酶抑制剂(Z-VAD-fmk)未能完全逆转化合物22b引起的胞浆内空泡和细胞死亡,所以空泡的形成在caspase依赖细胞死亡中扮演重要角色。2.化合物22b介导的旁凋亡依赖于内质网应激和蛋白合成(1)化合物22b诱导细胞内质网应激：western blotting结果显示,化合物22b可使内质网应激标志性蛋白GRP78的表达以时间依赖的方式上调,PERK与XBP1通路在早期被激活,表明化合物22b确实在早期可诱导由蛋白合成增加引起的内质网应激。CHOP在晚期被激活,启动内质网应激产生的凋亡通路。(2)化合物22b依赖于内质网应激和蛋白合成介导旁凋亡：内质网应激的抑制剂4-PBA可以显著逆转化合物22b引起的空泡样细胞死亡,此外,抑制蛋白翻译的放线菌酮(CHX)和抑制蛋白质转录的放线菌素D (Act-D)同样具有一定逆转作用,说明内质网应激和蛋白合成在化合物22b引起的空泡样细胞死亡中扮演重要角色。(3)蛋白酶体抑制剂与化合物22b具有协同作用：经典蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米具有诱导内质网应激的作用,二者分别显著增加化合物22b引起的细胞死亡,进一步验证内质网应激在化合物22b诱导的细胞死亡中的具有重要作用。3.化合物22b通过LC3的非自噬作用引起细胞空泡化(1)自噬在化合物22b引起的细胞毒中的作用：我们将pH敏感的LC3双荧光报告质粒转入肿瘤细胞,加药处理后发现自噬体并未与溶酶体融合,同时脂质型LC3B II曾加且聚集在空泡的边缘,自噬底物p62积累。自噬的抑制剂3-MA和E-64d可在很少程度上逆转空泡样细胞死亡。(2)LC3的非自噬作用：利用RNA干扰技术降低LC3B的表达水平后可以显著降低细胞内胞浆空泡的形成,以上结果提示我们,化合物22b诱导的胞浆内空泡与LC3B II存在时,非自噬的空泡形成作用相关。4.化合物22b的抗肿瘤活性在体内的验证通过裸鼠荷瘤实验发现化合物22b在体内同样具有良好抑制肿瘤生长作用,同时相较于同等剂量的阳性药物多西紫杉醇具有较低细胞毒性。第三部分地钱素C与MG132联用诱导肿瘤细胞旁凋亡的机制研究1.地钱素C与蛋白酶体抑制剂的联用效应在体内的验证在裸鼠荷瘤实验中,根据肿瘤体积及重量等数据显示,地钱素C与蛋白酶体抑制剂存协同作用,且联用组与高剂量硼替佐米组相比,具有相当的抑瘤效果,同时不产生明显肝毒性。说明二者的联用可为临床用药提出指导性意义。2.PLIN2可能参与地钱素C与MG132联用诱导的细胞空泡化(1)根据基因差异表达谱芯片结果,我们筛选出协同上调5倍以上的差异基因,并进一步选择PLIN2研究在地钱素C与MG132联用诱导的细胞空泡化中的作用。(2)利用RNA干扰技术降低PLIN2基因表达后,地钱素C与MG132联用引起的空泡被显著消除,说明PLIN2可能与胞浆内空泡现象相关。结论：1.通过对多种天然化合物进行活性及诱导肿瘤细胞胞浆空泡现象的筛选,确定22b和地钱素C为潜力化合物,针对二者诱导的旁凋亡进行深入地机制研究。2.化合物22b可以引起肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和空泡化现象。3.化合物22b诱导以空泡化现象为特征的旁凋亡依赖于内质网应激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。4.动物实验的结果表明,地钱素C与蛋白酶体抑制剂存在协同作用,二者联用可以增加抑瘤效果同时减少药物的毒性。5.根据基因差异表达谱芯片结果筛选,PLIN2可能参与地钱素C与MG132联用诱导的细胞空泡化。创新点与不足之处：1.创新点1.1首次报道以苯并喹诺里西啶类化合物为模型研究肿瘤细胞旁凋亡的机制,且通过实验验证,化合物22b引起的空泡化和细胞死亡依赖于内质网应激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。1.2首次报道地钱素C与蛋白酶体抑制剂具有协同作用,并在动物体内进行验证；首次报道根据基因差异表达谱芯片结果筛选出的PLIN2可能参与地钱素C与MG132联用诱导的细胞空泡化。2.不足2.1 LC3在非凋亡依赖的细胞死亡中通过自噬途径和非自噬性作用这两方面扮演重要角色,有文献报道ATF4在内质网应激产生后显著上调,通过其转录因子的作用可对LC3的表达进行调节,但是否存在其他调控机制仍需深入研究。下一步工作将通过寻找与LC3相互结合蛋白确定其与空泡形成之间的关系。2.2前期结果表明,地钱素C可以抑制蛋白酶体活性,当其与蛋白酶体抑制剂MG132联用后,二者具有协同作用,地钱素C与MG132对蛋白酶体的抑制是否为互补作用,以及两者的协同是否存在除蛋白酶体抑制之外的其他机制,即地钱素C的靶点研究,都需要进一步验证及讨论。2.3 PLIN2与脂肪代谢有关,但其如何在地钱素C与MG 132诱导的胞浆内空泡的形成中起作用,以及PLIN2的上游表达调控仍需深入探讨,这一部分工作正在进行中。