金属蛋白是指以金属离子或者其金属团簇为辅基或辅因子的蛋白质。在蛋白质的整体框架中,有近一半属于金属蛋白。它们的功能多种多样,涉及生物体内稳态调节、电子传递、氧化应激、基因调控、信号转导和物质/能量代谢等各个方面。金属蛋白常常处于生理与病理过程中的关键环节,金属蛋白的表达,定位,分布及其结构与功能的改变与生理/病理变化密切相关。金属蛋白对金属离子往往拥有特异选择性,而金属离子的结合又能诱导蛋白结构与功能的变化。本文对生理/病理过程中某些重要功能的金属蛋白进行了克隆、表达与纯化；蛋白质结构与性质表征；结构与功能关系以及相关分子机制展开深入研究。详细内容如下：第一章详细综述了金属蛋白的结构特点与生理功能；目前金属蛋白研究的热点领域以及金属蛋白研究中常用的方法手段。第二章和第三章系统地研究了人病原体微生物艰难梭菌(C. difficile)超氧化物歧化酶(SODcd)的结构、功能与抑制及其金属特异性分子机制。C. difficile是一种耐药性厌氧芽孢杆菌,容易感染服用了抗生素的病人,引发严重假膜结肠炎(癌)。第二章中,我们首次克隆表达了SODcd，解析了它的晶体结构,测定了其SOD酶活性,利用蛋白质虚拟对接计算和等温量热滴定的方法探索了2-甲氧基雌二醇(2-ME)对MnSODcd酶活的抑制,发现2-ME可以结合在MnSODcd的二聚界面上(解离常数为～8.6μM),从而干扰两个MnSODcd单体金属中心之间的联系,达到抑制其活性的效果。我们同时发现SODcd的金属中心可被多种金属离子占据,但是只有Mn和Fe离子是活性金属,Co、Cu、Ni离子替代Mn的SODcd没有SOD活性。该SODcd表现出显著的金属特异性,结合错误的金属会导致活性降低或失活。因此,第三章详细研究了SODcd金属特异性的分子机制。金属平衡透析,蛋白质内源荧光,变温CD光谱实验表明Apo-SODcd竟然对Co2+的亲和力最大,而且Co2+ -sub-MnSODcd在热力学上最稳定。这个结果同时被DFT计算得到的金属取代反应自由能所确认。为了进一步研究SODcd金属反应性,我们用蛋白质酸变性的方法制备了Mn2+, Fe3+, Co2+单一金属占据的SODcd,金属离子的纯度用ICP-MS, UV/Vis, EPR等方法表征。酶活性实验显示MnSODcd的活性最高,Fe-sub-MnSODcd的活性只有MnSODcd的1/10,而Co-sub-MnSODcd完全没有活性!这三种SODcd的晶体结构显示它们的金属中心都呈现三角双锥五配位状态,其附近均存在一个由Tyr60, Tyr64, Gln178以及金属离子配位溶剂水组成的氢键网络。晶体结构和DFT NBO计算结果显示这个氢键网络存在区别：对于Gln178-H2O氢键强度：MnSODcd< Fe-sub-MnSODcd< Co-sub-MnSODcd;对于Gln178-Tyr64氢键强度：MnSODcd> Fe-sub-MnSODcd> Co-sub-MnSODcd。SOD的歧化反应需要金属中心的氧还电势处在超氧阴离子氧化(0.89 V)和还原(-0.16 V)电势的中点。Gln178-H2O氢键可以通过调节金属离子的氧化还原电势来影响SOD活性；另一方面,Gln178-Tyr64氢键通过定位活化底物结合从而影响活性。我们通过电化学和光谱滴定研究表明MnSODcd的活性中心具有最佳的歧化电势和最高的底物结合常数,这可以解释这三种SODcd的活性差异。综合实验结果,金属的内在属性(d电子构型,配位化学)和SODcd精细的氢键网络共同决定了SODcd的金属特异性,这个推论也被SODcd反应过渡态自由能所支持。这些结果为MnSODcd特异性的抑制剂开发提供了基础。第四章研究了人病原体微生物梅毒螺旋体(T. pallidum) TroR金属依赖的DNA结合性质。梅毒螺旋体是造成人梅毒的病原菌。TroR是一种调节金属内稳态平衡的负反馈基因转录因子：当细胞内金属离子浓度高时,它能被激活发生构象变化,从而结合ATPase型金属转运蛋白troABCD上游回文序列,抑制其表达,降低金属的摄取；当金属浓度低时,它能够去抑制,导致troABCD表达上升。我们利用一种新颖的“双标签”方法成功地在大肠杆菌中可溶性表达了TroR蛋白。研究表明TorR能够结合Co2+, Ni2+, Mn2+,但不能结合Zn2+。变温CD, ANS荧光实验表明只有Co2+和Mn2+能够造成TroR构象变化。通过定点突变研究,发现TroR第11位天冬酰胺残基对其金属结合和构象变化有重要的影响。EMSA,荧光各向异性以及ITC实验结果表明只有在Mn2+存在下,TroR才能结合troABCD启动子DNA。因此,TroR是锰离子特异性依赖的金属调控蛋白。第五章详细研究了淀粉样前体蛋白(APP)和死亡受体因子6(DR6)介导神经元细胞凋亡的结构基础和分子机制。APP是一种含有多个胞外结构域的单次跨膜蛋白。APP可以在各种细胞器膜系统中被分选和加工形成多种具有独立功能的片段,如sAPPα和sAPPβ等。据报道,在神经营养缺乏的条件下,小鼠背根神经脊APP可以被切割成～35 kD的N端片段(N-APP),它可以与DR6相互作用,启动下游caspase通路,从而造成神经元凋亡和神经突修剪。本章研究了N-APP与DR6结合的结构基础；AD病人大脑中过载的Cu2+,Zn2+对其作用有何影响以及N-APPs细胞毒性的分子机制。运用生物物理技术(ITC, FRET,晶体结构,小角散射,蛋白质/蛋白质对接技术)表征了N-APP和DR6相互作用以及Cu2+,Zn2+对这种作用的影响。我们提出了APP18-286结合DR6胞外富含半胱氨酸结构域(CRD)的结构模型,显示～35 kDAPP18-286主要通过APP18-126的表面疏水口袋和APP210-286富含负电荷酸性区结合DR6 CRD。Cu2+, Zn2+可以联合促进这种结合。神经瘤细胞和原代神经元毒性实验表明N-APPs可以通过与DR6相互作用,激活caspase通路和诱导细胞内ROS的产生协同造成神经元的凋亡和轴突的修剪。N-APP/DR6相互作用模型和细胞实验结果将为基于结构的AD拮抗剂开发提供基础。据报道,APP E2结构域(简称E2)具有亚铁氧化酶活性,与膜铁转运蛋白(FPNl)作用介导细胞内Fe2+外排,防止细胞内Fe2+的聚集和氧化应激,从而有利于脑铁稳态平衡。但是随后另一课题组却反驳E2的亚铁氧化酶活性,他们认为E2甚至不能结合Fe2+。Fe在生物体内的价态变化涉及到其转运,储存,外排和氧化应激等各个过程。第六章初步探索了E2在脑铁稳态平衡中作用。光谱滴定,EPR, ITC,电化学等实验表明E2虽然不结合Fe2+,但是能够结合Fe3+。而且可以降低Fe3+/Fe2+的氧还电势,减少Fe3+的还原和Fe2+的生成,从而可能减少Fe2+引起的氧化应激。此外,E2可能与FPN1相互作用,使其不被蛋白酶体降解,从而使它有机会偶联其他亚铁氧化酶将Fe2+排出细胞外。因此,本章同时构建E2与FPNl嵌合体蛋白,为研究它们的相互作用奠定了基础。