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背景对HIV自然感染过程进行的大量研究表明,HLA介导的具有细胞毒作用的CD8+T淋巴细胞(CTL)应答反应在控制病毒的复制和疾病的进展中具有重要作用。然而许多研究发现慢性HIV感染时HIV特异性的T细胞出现严重的功能损伤,如不进行抗病毒治疗,绝大多数HIV感染者的免疫功能将进行性下降,最终机体免疫系统出现全面的崩溃现象,HIV感染者发展到艾滋病期并出现机会性感染等艾滋病的相关症状。HIV感染过程中特异性T细胞免疫功能损伤机制的研究对艾滋病疫苗研制和艾滋病免疫治疗具有重要意义。目前有关HIV感染时细胞免疫损伤的确切机制还不明确,近几年的研究提出了PD-1/PD-L和Galectin-9/Tim-3这两个信号通路在细胞免疫中的负性调节作用,它们的激活可能是引起HIV感染时细胞免疫功能衰竭的重要因素。目的分析HIV感染者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞PD-1和Tim-3的表达水平及其与HIV疾病进展的关系,并结合感染者CTL免疫应答的功能特征及体外阻断实验的结果,综合评价PD-1和Tim-3在HIV感染细胞免疫调节中的作用,初步探讨HIV感染细胞免疫损伤的机制。方法按知情同意原则采集29名健康对照和72名HIV感染者EDTA抗凝静脉血进行研究。以Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从EDTA抗凝静脉血分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC).应用流式细胞表面染色技术检测正常对照和H1V感染者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3的表达水平,应用胞内因子染色(ICS)的方法检测43例HIV慢性感染者的细胞免疫应答特征以及10例HIV感染者阻断前后免疫应答水平的变化。使用SigmaPlot 1001和GraphPad Prim 5.0进行统计学分析和作图,用双侧t检验(两组数据呈正态分布,且方差齐)或Mann-Whitney U检验(非正态或方差不齐)比较组间差异,相关性分析的统计学检验采用Pearson相关(正态分布)或Spearman秩相关(非正态分布)。阻断前后细胞因子分泌水平的比较采用配对资料的t检验(差值呈正态分布)或配对资料的秩和检验(差值呈非正态分布)。假设检验的水准a等于0.05。结果(1)正常对照CD4+T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平的均值分别为16.240%和18.120%,CD8+T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平的均值分别为18.450%和23.260%,明显低于HIV感染者(PD-1/CD4：20.240%；Tim-3/CD4：22.050%；PD-1/CD8：30.395%；Tim-3/CD8：25.370%),差别均具有统计学意义。(2)HIV感染者的CD4+/CD8+T细胞表面PD-1表达水平与CD4+T细胞计数负相关(CD4：r=-0.27,P=0.0222；CD8：r=-0.401,P<0.001)；CD8+T细胞表面PD-1表达水平与血浆病毒载量呈正比(r=0.247,P=0.0368)；HIV慢性感染者的CD4+/CD8+T细胞表面Tim-3表达水平与CD4+T细胞计数呈负相关(CD4：r=-0.256,P=0.0482；CD8：r=-0.338,P=0.00851),慢性感染者的CD8+T细胞表面Tim-3表达水平与血.浆病毒载量呈正比(r=0.271,P=0.0364)。(3)按CD4+T淋巴细胞计数的高低将HIV感染者分为：CD4<200 cellsμl；200～350 cells/μl；350～500 cells/μl；≥500 cells/μl四组。随着CD4细胞数量的升高,CD4+T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3表达的百分比中位数降低(PD-1：29.90%、19.37%、18.76%、16.76%；Tim-3：31.40%、25.16%、22.14%、21.21%)。与此类似,各组研究对象的CD8+T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3表达水平的中位数也随着CD4细胞数量的升高而降低(PD-1：37.60%、32.40%、30.96%、20.92%；Tim-3：33.55%、25.37%、22.90%、21.93%)。统计学分析显示CD4<200cells/μl组与CD4≥500celIs/μl组T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平均具有统计学差异(P值均小于0.05)。(4)正常对照组、新发感染组、长期不进展组、慢性进展组和艾滋病组的CD4+T淋巴细胞表面PD-1表达的百分比的中位数分别为16.240%、25.155%、14.410%、18.150%和29.900%；CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达的百分比的中位数分别为18.450%、39.335%、17.835%、28.190%和37.600%；CD4+T淋巴细胞表面Tim-3表达的百分比的中位数分别为18.870%、24.851%、20.690%、22.790%和31.631%；CD8+T淋巴细胞表面Tim-3表达的百分比的中位数分别为22.470%、28.072%、21.640%、24.670%和32.582%。统计学分析表明,新发感染组和艾滋病组的T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平明显高于正常对照,而长期不进展组和正常对照组间T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平没有统计学差异。(5)流式细胞表面分子染色后,以PD-1-Tim-3为分析参数,设定单阳性细胞门(PD-1+Tim-3-和PD-1-Tim-3+)以及双阳性细胞门(PD-1+Tim-3+)。结果显示在CD4+T淋巴细胞中,HIV感染者的PD-1+Tim-3-单阳性细胞群的百分比的中位数为17.25%；PD-1-Tim-3+单阳性细胞群的百分比的中位数为20.25%；PD-1+Tim-3+双阳性细胞群的百分比的中位数为6.75%。PD-1+Tim-3-、PD-1-Tim-3+和PD-1+Tim-3+T细胞在CD8+T淋巴细胞表达的百分比的中位数分别为20.25%、21.86%、5.75%。单阳性细胞群比例明显高于双阳性细胞群比例。(6)HIV-1 B亚型全基因组肽库刺激反应阳性的T细胞(CD4+CD107a+、CD4+IFN-γ+、CD8+CD107a+、CD8+IFN-γ+)PD-1和Tim-3的平均荧光强度均高于反应阴性的T细胞亚群,尤其以PD-1增强表达更为明显。(7)HIV慢性感染者的CD4+T细胞表面PD-1和Tim-3的表达水平与CD4+/CD8+T细胞分泌细胞因子(CD107a+、IFN-γ+)的能力呈负相关。(8)特异性的抗体(anti-PD-L1和anti-Tim-3)体外阻断PD-1/PD-L1和Galectin-9/Tim-3信号通路后,CD4+PD-1+T细胞分泌CD107a+IFN-γ+的能力增强,CD4+Tim-3+T细胞分泌CD107a+、IFN-γ+和CD107a+1FN-γ+的能力均增强,CD8+Tim-3+T细胞分泌CD107a+的能力也有一定程度的恢复。结论(1)与正常对照相比,HIV感染者CD4+T细胞和CD8+T细胞表面PD-1和Tim-3的表达水平显著升高(P值均小于0.05)。(2)HIV感染者CD4+和CD8+T细胞表面PD-1的表达水平与CD4+T淋巴细胞计数呈负相关,CD8+T细胞表面PD-I的表达水平与血浆病毒载量呈正相关；而CD4+和CD8+T细胞表面Tim-3的表达水平与CD4计数和血浆病毒载量的关系仅在慢性感染者中发现。(3)按感染时间、CD4计数和病毒载量的水平将HIV感染者分为新发感染组、长期不进展组、慢性进展组和艾滋病组,结果显示PD-1和Tim-3表达水平在新发感染期和艾滋病期出现两个高峰,长期不进展者的PD-1和Tim-3的表达水平与正常对照相比无统计学的差异。(4)HIV特异性的T细胞(CD107a+ or IFN-γ+T细胞)表面增强表达PD-1和Tim-3。(5)PD-1和Tim-3的表达水平与机体细胞免疫功能状态(CD107a和IFN-γ)呈负相关,并且阻断PD-1/PD-L和Galectin-9/Tim-3信号通路可在一定程度上恢复细胞免疫功能,这些结果提示PD-1和Tim-3是T细胞表面的负调节因子,可为HIV的治疗提供新的靶点。