研究意义根据2008年全球癌症统计数据,食管癌位列全球十大最常见的癌症之一且大多数发生在发展中国家。由于诊断相对较晚并且治疗效果差,食管癌在我国是致死率最高的肿瘤之一。食管癌是一种常见的恶性肿瘤,其致死率在全球范围内居恶性肿瘤的第六位。我国属食管癌的高发地区,GLOBOCAN的统计数据显示,2008年我国新发食管癌病例有25.8万和死于食管癌患者人数有21万。食管癌的致死率接近其发病率(每年4,82,300例),这与抗肿瘤药物治疗的失败密切相关。手术切除是食管癌主要的治疗方法,但是术后食管癌局部复发和远处转移是临床上面对的难题。近50%的食管癌患者在确诊时已有转移,丧失了手术切除全部病灶的机会。这些患者主要依赖于化学治疗,顺铂是治疗食管癌的一线药物,而肿瘤细胞对顺铂产生耐药性是造成化疗失败的主要原因。化疗的效果取决于肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但是在接受化疗的过程中,食管癌细胞往往对化疗药物产生耐药性,最终导致化疗的失败。尽管对于肿瘤细胞耐药性的产生已开展了深入的研究,但是耐药性产生的机制,以及如何克服耐药性产生从而提高化疗效果,仍有待进一步阐明。自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating)"现象,是真核细胞内降解蛋白和细胞器的一种溶酶体途径。自噬的特点就是形成双层膜包裹细胞器和蛋白质等形成自噬体(autophagosome),自噬体与溶酶体(lysosome)的融合提供了水解酶,而形成的自噬溶酶体(autophagolysosome)能够降解其所包裹的内容物。在肿瘤治疗中,自噬是一把双刃剑,自噬在细胞内的过程可以通过促生存和促死亡机制介导抗癌药物发挥细胞毒作用。在促生存方面,自噬能够通过清除受损细胞器,抑制生长因子和降低染色质稳定性,从而抑制肿瘤生长。相反,自噬的促死亡作用介导抗肿瘤药物的细胞毒作用。自噬引起的细胞死亡,即“自噬性细胞死亡(autophagy cell death)",也被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。更重要的是,很多肿瘤化疗药物能够通过各种途径诱导自噬发生。在这些肿瘤化疗药物中,顺铂是治疗实体瘤最重要的抗癌药物之一。然而,在人食管癌细胞,自噬是否参与肿瘤细胞对顺铂的耐药?相关的分子机制是什么?抑制自噬活性是否能够在体内外逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药?目前并未阐明。研究目的肿瘤细胞对治疗的敏感性受到自噬的影响。当接触化疗或放疗后,肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、受损的蛋白质等有害成分,而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质,并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件,从而保护肿瘤细胞免于发生凋亡性细胞死亡,以维持癌细胞的持续增殖。在长期使用化疗药物顺铂治疗食管癌时,食管癌细胞会对顺铂产生耐药,而自噬在食管癌细胞产生耐药中的作用机制,以及如何克服耐药性产生从而提高化疗效果,仍有待进一步阐明。我们的研究目的在于观察自噬在人食管癌细胞对顺铂耐药产生中的作用,并探讨其分子机制,进一步研究抑制自噬是否能够在体外逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药。并且,通过建立食管癌耐药细胞裸鼠移植瘤模型,进一步研究抑制自噬是否能够增强体内肿瘤细胞对顺铂的敏感性,达到增强疗效的目的。为临床上治疗食管癌,特别是对顺铂耐药食管癌的治疗提供新的思路和策略。研究方法我们将通过western blot、免疫荧光法、流式细胞仪检测酸性囊泡、透射电子显微镜法、小分子干扰RNA(siRNA)、流式细胞仪检测细胞凋亡、SA-beta-gal检测细胞衰老、MAPKs和mTORC1通路活性检测、克隆存活实验和食管癌耐药细胞裸鼠移植瘤模型等技术,深入研究自噬在人食管癌细胞对顺铂耐药中的作用及其分子机制。1. Western blot检测LC3-Ⅱ和p62的表达水平(1)检测自噬组成蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)表达水平,LC3存在两种可相互转化的形式即LC3-Ⅰ和LC3-II。LC-II定位于前自噬体和自噬体,是自噬体的标志分子,随自噬体膜的增多而增多。为了确定是自噬的发生而不是自噬过程(autophagy flux)受阻而引起LC3-Ⅱ的增加,我们拟将自噬溶酶体形成抑制剂CQ, bafilomycin A1与顺铂联合处理细胞,观察与顺铂单独处理细胞后LC3-Ⅱ表达的差异。(2)检测自噬底物蛋白p62的表达水平,p62参与自噬的过程并在自噬溶酶体中降解,因此,p62蛋白水平与自噬活性成反比。具体方案为药物处理细胞后,按一系列时间点(0-48h)用RIPA裂解液裂解细胞收集蛋白,BCA测定蛋白浓度后,以50μg蛋白量上样后SDS-PAGE电泳,然后湿法转膜转印至PVDF膜,5%脱脂牛奶或BSA室温封闭1h,一抗(p62和LC3,均购自cell signaling公司)4℃孵育过夜,洗膜,加二抗,室温孵育1h,洗膜,ECL发光,显影,定影。2.免疫荧光共聚焦检测LC3的分布和表达在进行免疫电镜时,样品的准备和固定是免疫电镜成败的关键。取对数生长期的EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于35mm共聚焦培养皿中,培养24h,吸弃培养基,药物组分为四组：1)空白对照组；2) cisplatin2.5μM;3) CQ50μM;4) cisplatin2.5μM+CQ50μM。药物处理48h后吸弃培养基。用PBS洗三遍(每遍5mmin)后,用4%多聚甲醛在室温下固定15min,用PBS洗三遍(每遍5mmin)。10%山羊血清室温封闭1h,兔源LC3一抗4℃孵育过夜,用PBS洗三遍(每遍5min),加荧光抗兔二抗Alexa Fluor488IgG,室温避光孵育1h,用PBS洗三遍(每遍5min),用DAPI室温避光染色5min,用PBS洗三遍(每遍5min),最后一次保留PBS于培养皿中,显微镜下观察拍照。3.吖啶橙(Acridine Orange, AO)染色检测酸性囊泡取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105/孔接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入2.5μM顺铂药物处理48h后,用4%多聚甲醛固定,干燥,加入终浓度为1μg/ml吖啶橙染液,染色5-10min,用PBS漂洗,在荧光显微镜下观察。由于酸度的不同,自噬溶酶体呈现红色荧光的细胞质囊泡(酸性囊泡),而核染成绿色。4.流式细胞仪检测酸性囊泡取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105/孔接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入2.5μM顺铂药物处理48h后,加吖啶橙(acridine orange)到各组EC109/CDDP细胞中,吖啶橙终浓度为1μg/ml,正常培养条件下孵育15min。移去培养基,用PBS洗1次。0.25%胰蛋白酶消化吹打细胞,1.5ml的PBS悬浮细胞,离心1500rpm×5rain。弃上清,0.5ml PBS重悬细胞,保持样本在冰上。然后上样,用流式细胞仪(BD FACSCanto TM Ⅱ flow cytometry, BD Biosciences, CA)检测,用FlowJo7.6软件分析。流式细胞仪检测到蓝色(488nm)激发光照射细胞后可见绿色(510～530nm)和红色(650nm)的荧光发出。5.透射电子显微镜取对数生长期的EC109和EC109/CDDP细胞,以1×x106/dish接种于60mm培养皿中。2.5μM顺铂处理48h后,用细胞刮收集细胞,4℃常规低速离心10min,弃上清液。细胞沉淀以2.5%的戊二醛溶液固定过夜,再以1%四氧化锇溶液处理固定细胞2次,每次1h。最后采用梯度乙醇溶液脱水后以环氧树脂812包埋细胞,制成超薄切片(100nm厚)。用饱和的醋酸双氧铀溶液和醋酸铅染色后,在透射电子显微镜下观察细胞并摄片,观察细胞自噬体的形成。6.克隆存活实验检测食管癌细胞对药物的反应克隆存活实验(colony formation assay)是用来研究自噬影响细胞死亡的一个重要方法。克隆存活试验是一种长时间的检测实验(long-term assay),我们用其检测细胞经顺铂处理后的恢复能力以及形成克隆的能力。同样采用敏感细胞EC109和HKESC-1以及对顺铂耐药EC109/CDDP和HKESC-1/cis展开研究。取对数生长期EC109,EC109/CDDP, HKESC-1和HKESC-1/cis细胞,以2×105/flash接种于T25培养瓶中,培养24h,吸弃培养基,药物处理或基因敲除后。吸弃含药培养基,用不含血清的培养基冲洗一遍,加入0.25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天至两周。再进行HE染色检测细胞克隆存活。7.siRNA沉默自噬关键基因Atg5和Atg7取对数生长期耐药食管癌细胞EC109/CDDP,以1×105、孔接种于6孔板中,转染时细胞要达到90～95%的融合,培养24h,吸弃培养基,细胞换成在含血清和双抗的正常培养基中,每孔2ml培养基,放入培养箱中培养,等待转染。配制溶液A：每100μl培养基中含有150ng Atg5siRNA或Atg7siRNA,在溶液A中加入转染试剂12μ1/孔,加入的时候要小心滴入,并轻轻摇使溶液混合均匀,室温中放置10min。每孔100μl轻轻加入6孔板中,待6孔板都加完后,画十字的轻轻晃动平移6孔板使溶液混合均匀。放入培养箱中培养48h。48h后采用western blot方法检测Atg5或Atg7确定敲除效果。之后同样操作转染步骤,转染48h后加入顺铂2.5μM处理48h,用0.25%胰酶消化,以3000/孔接种于6孔板中,培养10天,再进行HE染色,观察克隆存活情况。8.流式细胞术检测顺铂对敏感细胞和耐药细胞凋亡的影响取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以3×105/well接种于60mm培养皿中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后收集细胞,用不含EDTA Trypsin消化,2ml/well,消化时间要短,注意观察,一消化下来就马上用全培终止消化,收集在15ml离心管中,800rpm,5min;用PBS洗两遍,第一遍PBS的量2ml/Tube,800rpm,5min;第二遍PBS的量2ml/Tube,并转移至流式管,800rpm,5min;倒掉上清液,用滤纸倒靠滤干；配制1xBinging Buffer,以100μl/Tube加入流式管中悬浮细胞,加入PI2.5μl/Tube, FITC2.5μl/Tube;室温放置10min；最后以400μl/Tube加入1xBinging Buffer,流式机上样检测。9.p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性分析U0126对顺铂促衰老作用的影响取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM处理细胞48h,撤去药物,分别1天,2天和4天后吸弃培养基,每个孔用1ml PBS各洗两次,小心吸取防止细胞掉落,每个孔加入1.5ml1×Fixation Buffer室温中放置6-7分钟,在固定的这段时间内配制Staining Mixture,固定后每个孔用1ml PBS各洗三次后,加入新鲜配制好的Staining Mixture染液中,37℃孵育过夜,显微镜下观察细胞蓝染细胞数目。每种细胞计数四个视野,每个视野至少100个细胞,计算细胞染色阳性率。为了研究联用U0126后对顺铂诱导食管癌细胞衰老的影响,取对数生长期EC109和EC109/CDDP细胞,以1×105/well接种于6孔板中,培养24h,吸弃培养基,加入顺铂2.5μM, U0126和顺铂2.5gM联用U0126处理细胞48h,撤去药物,吸弃培养基,按上述步骤检测食管癌细胞衰老情况。10.MAPKs和mTORC1通路活性的检测药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。分别使用抗ERK1/2, phosphor-ERK1/2, p38, phosphor-p38, JNK, phosphor-JNK的单克隆抗体(cell signaling卫生),采用western blot的方法,检测蛋白的磷酸化来反应通路的激活或抑制。mTORC1下游有两个关键的底物70kDa核糖体蛋白S6激酶(70kDa S6Kinase, S6K)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(eukaryotic translational initiation factor4E-binding protein1,4E-BP1)。活化的mTORC1磷酸化激活S6K,磷酸化4E-BP1可以解除对eIF4E的抑制。这两者的磷酸化程度同mTORC1活性正相关。此外,mTOR在Ser2481位点上会自我磷酸化。当mTORC1活性增强时,该位点上的磷酸化也会增强。因此,我们可以通过检测S6K,4E-BP1和mTOR的磷酸化来显示mTORC1的活性。具体方法为：药物处理细胞后,收集细胞并提取总蛋白。采用western blot的方法,检测mTOR,phospho-mTOR(ser2481), S6K, phosphor-S6K,4E-BP1和phospho-4E-BP1的表达。11.裸鼠移植瘤模型研究氯喹与顺铂联合用药后对移植瘤生长的影响建立裸鼠人食管癌细胞移植瘤模型的方法：4到6周的雌性BALB/c nu/nu裸鼠用于该研究。将肿瘤细胞悬液接种到裸鼠的右背部皮下,每只裸鼠接种肿瘤细胞的个数为2×106。然后每三天用游标卡尺测量一次肿瘤的大小。肿瘤的大小按照以下公式计算：V(体积)=L×W2/2,其中L是肿瘤纵轴的长度,W是肿瘤横轴的长度。当肿瘤的体积均值达到约130mm2,开始药物处理。按照如下方案给药：(1)对照组；(2)顺铂给药组(3)氯喹给药组；(4)联合给药组。给药过程中按上述方法每三天测量肿瘤的大小。除了检测肿瘤体积这一指标外,我们还拟检测肿瘤组织中的细胞自噬。给药结束后,取出肿瘤组织并处死裸鼠。肿瘤组织切片后透射电子显微镜观察自噬体的形成。12.统计学分析采用GraphPad Prism5.0软件包进行数据分析,数据结果以均数±标准差(Mean±SD)表示；两组之间均数比较采用两样本t检验,三组及以上均数比较采用One-way ANOVA,多个处理组与一个对照组的比较采用Dunnett检验,P<0.05具有统计学显著性差异。实验结果1.顺铂是一个烷基化的抗肿瘤药物,是治疗食管癌的经典药物。经顺铂处理后,亲代食管癌细胞EC109不会发生自噬,但是对顺铂耐药食管癌细胞EC109/CDDP则会发生自噬。顺铂处理后,通过透射电子显微镜观察到耐药细胞EC109/CDDP超微结构,发现其胞浆内有自噬体和自噬溶酶体形成。在蛋白表达水平,耐药细胞EC109/CDDP的LC3-Ⅱ的表达明显增加；免疫荧光技术的结果也显示LC3-Ⅱ在胞浆内分布增多,与western blot的结果一致。吖啶橙染色和吖啶橙染色流式结果都显示,耐药细胞EC109/CDDP顺铂组的酸性囊泡与正常组比具有显著性差异(t=17.19,P<0.0001),顺铂处理后酸性囊泡数目显著多于对照组(P<0.001)。2.亲代细胞EC109和HKESC-1对顺铂很敏感,而耐顺铂细胞EC109/CDDP和HKESC-1/cis稳定的保持着对顺铂的耐药,对耐药细胞的耐药倍数分别达到约8倍和3倍。克隆存活实验也证实了,2.5μM顺铂处理后,EC109和EC109/CDDP两组对比具有显著性差异(t=234.6,P<0.0001),EC109/CDDP细胞克隆数目显著高于EC109细胞(P<0.001)。HKESC-1和HKESC-1/cis两组对比具有显著性差异(t=27.13,P<0.0001),HKESC-1/cis细胞的克隆数目显著多于HKESC-1细胞的克隆数目(P<0.001)。这一结果提示对凋亡敏感的亲代细胞对顺铂的敏感性高于拮抗凋亡的耐药食管癌细胞。CDDP细胞对照组,氯喹组,顺铂组和氯喹联用顺铂组各组间具有显著性差异(F=58.52,P<0.0001),氯喹(10,20,50μM)联用顺铂组的克隆数目显著低于顺铂组(P<0.001)。在HKESC-1/cis细胞也得到同样结果。这一结果表明氯喹抑制自噬增强了耐药细胞对顺铂的敏感性。空白敲除对照组,Atg5敲除对照组,空白敲除顺铂组和Atg5敲除联用顺铂组,各组间整体间具有显著性(F=261.1,P<0.0001)。Atg5敲除联用顺铂克隆数目显著低于空白敲除顺铂组(P<0.001),即敲除Atg5增加了抗耐药细胞EC109/CDDP对顺铂的敏感性。敲除Atg7也得到同样的结果。这证实了自噬对顺铂处理过的耐药细胞是一种细胞保护机制,维持了细胞克隆存活能力。而且自噬激活过程一定有Atg5和Atg7的参与。3.顺铂处理组EC109细胞的mTOR蛋白在2448位的磷酸化水平显著高于对照组(t=14.29,P=0.0001),而mTOR蛋白在2481位的磷酸化水平与对照组无显著性差异(t=1.972,P==0.1199)；在EC109/CDDP细胞,mTOR蛋白在2448位的磷酸化水平显著低于对照组(t=17.30,P<0.0001),并且mTOR蛋白在2481位的磷酸化水平也显著低于对照组(t=6.337,P=0.0032)。在EC109细胞,顺铂处理组的p85S6kinase蛋白磷酸化水平与对照组无显著性差异(t=1.642,P=0.1759), p70S6kinase蛋白磷酸化水平与对照组也无显著性差异(t=1.280,P=0.2697)；在EC109/CDDP细胞,顺铂处理组p85S6kinase蛋白磷酸化水平显著低于对照组(t=13.27, P=0.0002), p70S6kinase蛋白磷酸化水平也显著低于对照组(t=70.35,P<0.0001)。在EC109细胞,顺铂处理组4E-BP1蛋白磷酸化水平显著高于对照组(t=62.97,P<0.0001)；在EC109/CDDP细胞,4E-BP1蛋白磷酸化水平也显著低于对照组(t=25.01,P<0.0001)。以上统计分析结果说明了顺铂处理后抑制了EC109/CDDP耐药细胞mTOR两个下游底物70kDa核糖体蛋白S6激酶(70kDa S6Kinase, S6K)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(eukaryotic translational initiation factor4E-binding protein1,4E-BP1)的磷酸化,即顺铂抑制了耐药细胞mTOR的活性。4.在EC109细胞,顺铂处理不同时间后,phospho-ERK1的表达水平与0h组有显著性差异(F=70.22,P<0.0001),都显著高于0h组(P<0.001)；phospho-ERK2的表达水平升高得更明显,不同时间组与O h组有显著性差异(F=105.6,P<0.0001),都显著高于0h组(P<0.001)；phospho-p38的表达水平也升高,不同时间组都与0h组有显著性差异(F=364.5,P<0.0001),都显著高于0h组(P<0.001)；phospho-JNK1的表达水平也升高,不同时间组与O h组有显著性差异(F=16.88,P<0.0001),显著高于O h组(P<0.001); phospho-JNK2/3的表达水平也升高,不同时间组与0h组有显著性差异(F=5.413,P<0.0014),显著高于0h组(P<0.05)。在EC109/CDDP细胞也得到同样结果。以上结果说明顺铂激活了MAPKs通路中ERK, p38和JNK三条通路,诱导ERK, p38和JNK发生磷酸化,介导了顺铂诱导细胞凋亡作用。顺铂组,顺铂联用MAPKs通路抑制剂整体结果各组之间具有显著性差异(F=640.0,P<0.0001),再通过Tukey检验分析,发现U0126联用顺铂组的克隆数目显著高于顺铂组(P<0.001),即U0126拮抗了顺铂抑制克隆存活的能力,而SB203580和JNK inhibitor Ⅱ联用顺铂组的克隆数目与顺铂组无显著性差异(P>0.05),对顺铂抑制克隆存活的能力无明显影响。在EC109/CDDP细胞我们也得到了同样的结果。可见,在MAPKs家族中,只有ERK参与了顺铂诱导细胞死亡的调节。顺铂诱导食管癌细胞发生死亡的形式是凋亡,而且敏感细胞EC109发生凋亡比例更大。顺铂均能诱导敏感细胞EC109和耐药细胞EC109/CDDP细胞发生凋亡,但是敏感细胞EC109发生凋亡更加明显。ERK通路抑制剂U0126拮抗了顺铂的促凋亡作用。顺铂和U0126处理EC109细胞整体结果各组之间具有显著性差异(F=696.1,P<0.0001),顺铂组有一半以上的细胞发生衰老,显著多于对照组(P<0.001),而顺铂联用U0126组发生衰老的细胞数显著低于顺铂组(P<0.001)。在EC109/CDDP细胞上我们也得到类似的结果,EC109/CDDP细胞整体结果各组之间也具有显著性差异(F=64.9,P<0.0001),顺铂组有约10%的细胞发生衰老,显著多于对照组(P<0.001),虽然发生衰老的细胞比敏感细胞少,但顺铂联用U0126后同样能使发生衰老的细胞数显著低于顺铂组(P<0.01)。顺铂促衰老的作用能被U0126所拮抗。也说明了顺铂诱导食管癌细胞发生衰老是通过激活ERK通路。5.我们建立EC109/CDDP食管癌细胞裸鼠移植瘤模型,顺铂组虽然抑制肿瘤细胞的生长,抑瘤率为10.70%,但肿瘤相对体积与对照组没有显著性差异(P>0.05),但顺铂联用氯喹后,显著的抑制肿瘤生长,抑瘤率增至54.62%,肿瘤相对体积显著低于对照组(P<0.001)。单独顺铂给药组给药后不同天数组与对照组比较具有显著性差异(F=2.311,P=0.0383),但肿瘤增长受到一定抑制,随着天数增加肿瘤体积增长幅度减少,给药后第26天肿瘤体积依然显著大于给药后第一天(P<0.05)；而氯喹联用顺铂给药组给药后不同天数组与对照组没有显著性差异(F=0.7683,P=0.6158),肿瘤增长受到显著抑制,给药后任何一天的肿瘤体积与给药后第1天的肿瘤体积没有显著性差异(P>0.05),即氯喹联合顺铂基本抑制了肿瘤的增长。。单独顺铂给药组和氯喹联合顺铂给药组的裸鼠体重没有发生明显下降。综上所述,我们的实验结果证实了,在体内和体外氯喹都能够增强耐药细胞对顺铂的敏感性。本文结论我们的研究结果发现顺铂诱导耐药细胞EC109/CCDP发生自噬,并且自噬抑制剂氯喹能够增强顺铂的抗肿瘤作用。这一结果提示耐药细胞很可能通过促进生存的自噬机制从顺铂的细胞毒作用中恢复并继续保持增殖活性。最后,在信号通路方面我们发现顺铂激活了ERK信号通路,并且ERK激酶抑制剂U0126能够拮抗顺铂的抗肿瘤作用。顺铂抑制了nTOR信号通路,mTOR信号通路是调节自噬的一个重要信号通路,它是自噬的负调节因子。mTOR的抑制一定程度上激活了自噬活性。裸鼠移植瘤模型体内实验也证实,氯喹能够增强耐药细胞对顺铂的敏感性。