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目的:以牡丹皮（Moutan Cortex）为原料,对其成分提取纯化和结构表征,揭示丹皮抑制氧化应激和急性肝损伤的作用及其物质基础。通过H2O2诱导HepG2细胞氧化应激体外模型和CCl4诱导小鼠急性肝损伤体内模型,研究活性成分潜在的抗氧化机制,评估活性成分单独和联合用药的治疗效果,探讨其独立性和协同性。方法和结果:1、将干燥的牡丹皮根部粉碎,用85%乙醇超声提取3次,减压浓缩成浸膏,加入适量水混悬,通过不同的溶剂萃取得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位。然后利用硅胶柱层析和结晶法等纯化得到4种活性成分。通过13C NMR,1H NMR和MS鉴定其结构,确定该活性成分分别为丹皮酚（Pae）、槲皮素（Qct）、β-谷甾醇（Sit）和没食子酸（Ga）,其HPLC测定纯度分别为:95.38%,95.13%,96.90%和95.24%。2、体外实验,评价和比较牡丹皮中的活性成分（Pae、Qct、Sit和Ga）体外抑制氧化应激的能力。采用H2O2诱导HepG2细胞作为氧化应激细胞模型,观察活性成分对氧化应激指标的影响。通过CCK8实验确定4种活性成分和H2O2对HepG2细胞株的给药浓度和时间,Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡率,荧光显微镜分析细胞内活性氧自由基（ROS）的含量,ELISA实验检测细胞上清液中总的抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性,Western Blot和EMSA实验测定氧化通路相关蛋白以及Nrf2-ARE的结合表达。同时加入Nrf2抑制剂（ML385）,研究Nrf2及下游蛋白的表达。体外实验结果表明:随着活性成分浓度、H2O2浓度和时间增加,细胞存活率显著降低,活性成分能够不同程度地减少细胞凋亡率,抑制ROS的含量,增加T-AOC的能力、提高CAT和SOD的活性,激活Nrf2/Keap1通路,增强Nrf2-ARE的结合力,增加HO-1和NQO1蛋白的表达。加入ML385和活性成分共同培养细胞后,Nrf2及下游HO-1和NQO1蛋白的表达均被抑制;未加入ML385时,Pae和Qct显著促进Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表达,这也证明活性成分是通过激活Nrf2/Keap1通路抑制氧化应激。实验结果发现Pae和Qct的抗氧化效果较好,为后续研究肝损伤提供理论和物质基础。3、体内实验,探讨Pae和Qct单独给药和联合给药对急性肝损伤小鼠的治疗效果。采用CCl4腹腔注射小鼠造成急性肝损伤模型,探讨其抗氧化和护肝作用的独立性或协同性。通过苏木素-伊红（H&E）和免疫荧光染色观察肝组织切片,ELISA分析小鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）和SOD活性,Western blot检测肝脏中Nrf2和HO-1蛋白的表达,RT-PCR检测肝脏中Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA水平。体内实验结果表明:Pae能够显著缓解炎症因子浸润、细胞充血和细胞坏死等症状,降低ALT和AST活性、增加GSH和SOD活性,提高Nrf2和HO-1蛋白在肝脏中的表达,增加Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA水平。此外,其他单体化合物均能不同程度地减轻炎症的症状。Pae的抗氧化效果明显优于Qct,且未见明显的协同效果,Pae和Qct发挥抗氧化作用具有独立性而非协同性。结论:综上所述,从牡丹皮中提取的活性成分,经过鉴定分别为Pae、Qct、Sit和Ga。体外实验结果表明:这4种活性成分通过激活Nrf2/Keap1信号通路,清除ROS,提高抗氧化能力,从而抑制氧化应激。通过体外实验发现Pae和Qct的抗氧化能力比Sit和Ga强,选用Pae和Qct单独给药和联合给药研究其对CCl4诱导的肝损伤的影响。体内实验结果表明:Pae、Qct及Pae和Qct联合组都具有抗氧化和保肝作用,但Pae单独给药的效果更强。因此,牡丹皮中的Pae和Qct发挥抗氧化作用是独立的而非协同作用。