研究背景:二十世纪90年代以来发表的一系列回顾性分析显示,全球许多国家和地区的男性精液质量在过去数十年间呈现显著下降趋势。因此,探明人类精液质量下降的危险因素有助于提出和制定相关预防和治疗措施,对维护男性生殖健康具有重要的意义。精液质量受到遗传、环境、社会-心理-行为等多种因素的共同影响。随着中国经济社会的发展、城镇化进程的推进以及生活方式的转变,人们生活节奏日益紧凑,心理压力增加呈普遍趋势,心理疾病的发病率也与日俱增。大量流行病学证据表明,心理应激（如抑郁症、创伤后应激障碍）与男性精液质量呈负相关。动物实验也证明心理应激可诱导雄性大（小）鼠血清睾酮水平下降和生精细胞凋亡。然而,以上研究还存在两个方面的不足:大部分流行病学研究招募的志愿者为不孕不育或罹患严重心理疾病（如抑郁症）的人群,其心理和生殖健康状况与普通人群有较大差异,因此这类研究可能存在志愿者选择偏倚;心理应激动物模型多为单一因素刺激,不能真实反映人们在社会生活中面临的多样的、长期的弱刺激以及由此导致的慢性心理应激状态。糖皮质激素水平的升高是机体对外界刺激的应激反应,可通过升高血糖水平使机体适应外界环境的变化,因此糖皮质激素也被称为“应激激素”。然而,慢性心理应激导致糖皮质激素水平的持续升高却被证明有明确的生殖毒性。糖皮质激素可通过作用于睾丸间质细胞上的糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor,GR）诱导抑制睾酮的合成。GR不仅仅存在于睾丸间质细胞,也表达在处于早期阶段的生精细胞（精原细胞和精母细胞）。那么,慢性心理应激所诱导的糖皮质激素升高是否通过GR介导早期生精细胞的损伤尚不明确。因此,本课题主要分为三部分:第一部分为慢性心理应激致男（雄）性生殖损伤的人群流行病学调查。分别在两个重庆市普通人群中研究慢性心理应激与精液质量参数的关联。第二部分为动物模型的研究。在成功构建的大鼠不可预知慢性温和应激（Unpredictable chronic mild stress,uCMS）模型的基础上研究慢性心理应激对大鼠睾丸的损伤效应,并探讨GR在介导损伤中的作用。第三部分为细胞模型的效应和机制研究。以皮质酮（corticosterone,CORT）为受试物,以小鼠精原细胞系（GC-1）为研究对象,探究糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链蛋白（Glucocorticoid-induced leucine zipper,GILZ）在CORT诱导GC-1小鼠精原细胞周期阻滞中的作用,并探讨相关的分子调控机制。研究内容:1.大学生抑郁症状与精液参数的关联分析:MARHCS研究本课题组于2013²015年建立了“重庆市大学生男性生殖健康（Male Reproductive Health in Chongqing College Student,MARHCS）”队列人群,旨在研究社会-心理-行为和环境有害因素对男性生殖健康的影响。本研究选择2013年MARHCS队列研究中完成心理问卷量表的587名志愿者作为研究对象。采用汉化版的抑郁自评量表（Self-rated Depression Scale,SDS）检测志愿者的抑郁症状。同时记录志愿者的年龄、种族、禁欲时间、体育运动量、吸烟和饮酒等协变量信息。根据《WHO人类精液检验与处理实验手册》（第五版）指导原则收集研究对象精液样本,检测精液体积、精子活力、精子密度和精子总数。采集研究对象的外周静脉血,并采用核放射免疫法检测血清性激素水平。采用多元线性回归的方法分析大学生抑郁状态与精液参数的关联,并进一步分析了抑郁与体育运动对精子密度和精子总数影响的交互作用。2.工人工作压力与精液参数的关联分析:重庆市两区县人群研究本研究选择2014²015年在重庆市两区县（璧山县和丰都县）招募的384名社区男性职工作为研究对象。采用简化的工作压力问卷（Job Content Questionnaire,JCQ-22）评测研究对象工作压力的情况。JCQ-22含有22个条目,包括3个模块,分别为工作自主（Decision latitude,含9个条目）、工作需求（Psychological job demands,含5个条目）和社会支持（Social support,含8个条目）。其它调查信息包括年龄、禁欲时间、体育运动量、吸烟、饮酒等协变量信息。根据《WHO人类精液检验与处理实验手册》（第五版）指导原则,收集研究对象精液样本,检测精液体积、精子活力、精子密度和精子总数。采用多元logistics回归的方法分析工作压力与精液参数的关联,并探讨社会支持对该关联的调节作用（Moderating effect）。3.糖皮质激素受体在慢性心理应激诱导大鼠生精损伤中的作用研究采用大鼠建立为期42天的uCMS动物模型。uCMS造模结束后,利用旷场实验（Open-field test,OFT）、强迫游泳实验（Forced swimming test,FST）及糖水偏好实验（Sucrose preference test,SPT）三个经典的行为学实验评判动物模型是否构建成功。uCMS造模的同时用糖皮质受体（Glucocorticoid receptor,GR）拮抗剂RU486（1mg/kg/day）处理大鼠,以研究GR在慢性心理应激诱导生精损伤中的作用。实验共分为4组:对照组、RU486组、uCMS组和uCMS+RU486干预组。处理结束后,采集大鼠附睾、睾丸及血液样本,检测各组大鼠血清睾酮和皮质酮水平、附睾精子浓度、睾丸病理结构变化及睾丸GR表达水平,以评价慢性心理应激的睾丸毒性以及GR在介导损伤中的作用。此外,计数各组大鼠睾丸曲细精管中支持细胞、精原细胞、精母细胞和精子细胞的数量与比例,采用TUNEL法和流式细胞仪分别检测睾丸细胞凋亡水和生精细胞DNA含量,采用Western blot检测细胞凋亡和细胞周期阻滞相关蛋白的表达,以评价慢性应激对生精细胞凋亡和细胞周期进展的影响,明确慢性心理应激诱导生精上皮损伤的毒性特征。4.GILZ在糖皮质激素诱导的GC-1小鼠精原细胞周期进展阻滞中的作用机制研究采用小鼠精原细胞株（GC-1）,给予内源性糖皮质激素皮质酮（Corticosterone,CORT）处理,建立体外染毒细胞模型。采用CCK8、Annexin V/FITC染色及流式细胞仪分析等方法检测细胞增殖、凋亡及周期进展的改变,确定CORT的细胞毒性效应;同时采用GR拮抗剂RU486及GILZ基因的shRNA处理细胞,明确GR及其下游基因GILZ在CORT诱导的生精细胞增殖抑制和细胞周期阻滞中的作用;采用免疫共沉淀联合蛋白质谱的方法,检测与GILZ蛋白相结合的蛋白谱,明确GRP94为GILZ下游靶蛋白;采用BEP-NVP800抑制GRP94功能,以明确GRP94在CORT诱导的细胞G₀/G₁期阻滞中的作用;此外,检测GRP94的mRNA及蛋白水平变化,并采用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂放线菌酮处理细胞,观察CORT对GRP94蛋白合成、降解以及泛素化水平的影响;进一步联合GILZ的shRNA处理细胞,确定GILZ在CORT诱导GRP94蛋白泛素化降解中的作用。研究结果:1.大学生抑郁症状与精液参数的关联分析:MARHCS研究根据SDS量表计分规则及研究对象SDS得分,63名大学生被评定为抑郁状态（SDS评分≥53）,占总体的10.7%;524名大学生被评定为正常,占总体的89.3%。单因素分析显示:抑郁状态大学生的精子密度（66.9 vs.72.6×10⁶/ml,P=0.043）和精子总数（241.6vs.257.0×10⁶,P=0.024）显著低于正常组大学生。血清6项性激素水平在抑郁状态和正常大学生之间无显著差异（P>0.05）。校正混杂因素后,多元线性回归分析结果显示:与正常大学生比较,抑郁状态的大学生精子密度和精子总数分别下降18.90%（95%[CI]1.14%;33.47%,P=0.038）和21.84%（95%[CI]3.39%;36.90%,P=0.022）。进一步研究发现,抑郁和体育运动对精子密度的影响存在交互作用（P=0.033）,而对精子总数的影响没有交互作用（P=0.200）。上述结果证实:抑郁与精液质量负相关,且抑郁与体育运动对精子密度的影响存在交互作用。2.工人工作压力与精液参数的关联分析:重庆市两区县人群研究根据JCQ-22量表的计分规则,判定为有工作压力的为88人,占总体的22.9%;判定为无工作压力的为296人,占总体的77.1%。单因素分析结果显示:有工作压力的工人精子密度（36.2±43.0 vs.42.2±47.8[10⁶/ml],P=0.03）和精子总数（133.4±192.3 vs.154.2±205.2[10⁶],P=0.03）显著低于无工作压力的工人。校正混杂因素后,logistics回归分析结果显示,有工作压力的工人精子密度和精子总数不合格的的概率分别是无工作压力工人的2.14倍（95%CI 1.24-3.68,P=0.006）和1.95倍（95%CI 1.13-3.36,P=0.02）。进一步分析发现社会支持可以调节工作压力对精液质量的影响:在社会支持较低的工人中,工作压力较大的工人精子密度和精子总数不合格的概率分别是无工作压力工人的3.46倍（95%CI 1.62-7.36,P=0.001）和2.18倍（95%CI 1.04-4.59,P=0.04）;在社会支持较高的工人中,我们并未发现工作压力与精液参数之间有统计学上的关联（P>0.05）。上述结果证实:工作压力与精液质量负相关,且高水平的社会支持可以缓解工作压力对精液质量的负面影响。3.糖皮质激素受体在慢性心理应激诱导大鼠生精损伤中的作用研究OFT、FST及SPT结果显示,uCMS组大鼠呈现明显的抑郁样行为,证实uCMS模型建立成功。我们发现uCMS组大鼠的附睾精子密度显著减少,睾丸组织生精上皮发生明显病理学改变,提示慢性心理应激导致大鼠生精损伤。进一步分析发现uCMS组大鼠生精上皮中的精子细胞（Spermatids,SPT）数目显著减少、精子细胞凋亡增加,并且精原细胞（Spermatogonia,SP）发生明显的G₀/G₁期细胞周期阻滞,同时观察到睾丸组织中细胞凋亡和周期进展相关蛋白表达的异常。GR拮抗剂RU486处理可显著改善uCMS组大鼠睾丸病理形态学的异常,提高精子细胞数量并拮抗精子细胞凋亡,降低凋亡相关蛋白的表达。同时也观察到RU486处理显著改善慢性应激所致的精原细胞G₀/G₁期细胞周期阻滞,提高周期进展相关蛋白的表达。此外,研究发现uCMS组大鼠血清皮质酮水平及睾丸组织GR蛋白表达水平明显升高,而RU486干预处理可显著降低慢性应激诱导的睾丸组织GR蛋白的高表达。以上结果提示,慢性心理应激可提高大鼠糖皮质激素水平,通过激活睾丸组织细胞的GR通路诱导睾丸精子细胞凋亡和精原细胞G₀/G₁期周期阻滞,最终导致睾丸生精上皮损伤和附睾精子数量的减少。4.GILZ在糖皮质激素诱导的GC-1小鼠精原细胞周期进展阻滞中的作用机制研究随着CORT染毒剂量增加,GC-1小鼠精原细胞活力逐渐降低。在0.5、5.0、50μM剂量条件下,细胞增殖抑制呈剂量依赖性升高,G₀/G₁期细胞比例显著增加并伴随着细胞周期G₁期向S进展相关蛋白CDK4、Cyclin D1和p-Rb表达的显著降低。GR拮抗剂RU486处理可明显抑制CORT诱导的细胞活力降低、G₀/G₁期进展阻滞以及相关蛋白表达的降低,提示GR参与介导CORT所致精原细胞损伤。同时,CORT可诱导GR蛋白表达升高及核转位,GILZ基因的mRNA和蛋白表达也呈现相似的改变趋势,而RU486处理可降低CORT诱导的GR蛋白表达和核转位,并降低其诱导的GILZ表达,进一步干扰GILZ的表达后观察到CORT诱导的细胞周期阻滞也得到缓解,这些结果提示受GR调控的GILZ表达异常参与介导了CORT所致的精原细胞周期进展阻滞。此外,通过蛋白质谱分析筛选出CORT处理后GILZ的相互作用蛋白,葡萄糖调节蛋白94（Glucose-regulated protein 94,GRP94）,并检测证实GILZ与GRP94蛋白的共定位和结合。功能分析显示,抑制GRP94蛋白可诱导细胞G₀/G₁期进展阻滞,干扰细胞周期进展调控通路AKT1-FOXO1-p15相关蛋白的表达。研究同时发现CORT可降低GRP94蛋白水平,并提高GRP94蛋白泛素化水平并诱导其降解,且干扰GILZ表达可显著减缓GRP94的降解。上述结果提示,CORT通过诱导GR的核转位及GILZ的转录表达,促进GILZ与GRP94蛋白的结合,并介导GRP94蛋白的泛素化降解,最后通过AKT1-FOXO1-p15通路参与调控精原细胞的G₀/G₁期阻滞。研究结论:本研究同时在两个重庆市的普通人群证明慢性心理应激与男性精子密度和精子总数负相关,并发现心理应激和社会-行为因素（社会支持和体育运动）对精液参数的影响存在交互作用。动物实验证实GR介导了慢性心理应激诱导的大鼠精子细胞凋亡和精原细胞G₀/G₁期细胞周期阻滞。体外实验进一步揭示了糖皮质激素致生精细胞损伤的分子机制:糖皮质激素诱导的GR核转位促进了GILZ的转录表达,GILZ通过诱导GRP94蛋白泛素化降解参与介导精原细胞的G₀/G₁期阻滞。本研究发现了慢性心理应激生殖毒性的损伤效应及其特征,明确了糖皮质激素受体在慢性心理应激致雄性生殖损伤中的作用及相关机制,揭示了GILZ基因介导糖皮质激素诱导的生精细胞周期阻滞的分子调控机制,有可能为慢性心理应激诱导的男（雄）性生殖损伤提供新的潜在的药物干预靶点及理论支持。