论文部分内容阅读
摘要第一章RA和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠离焦型近视眼视网膜色素上皮-脉络膜复合体中的表达目的：通过建立豚鼠离焦型近视模型,观察视黄酸(RA)、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在视网膜色素上皮(RPE)-脉络膜复合体中的动态表达变化,探讨豚鼠近视眼中RA、ZO-1、Occludin在近视眼中可能的调控作用。方法：取3周龄三色豚鼠(体重约150-180g)30只(雌雄不限),随机分为A组：正常组(n=15),豚鼠双眼均不佩戴镜片；B组：离焦组(n=15),豚鼠右眼均佩戴-6.00D的凹透镜作为实验眼,左眼均不佩戴镜片作为自身对照眼。分别于实验前、实验第3天、第7天、第14天均对各组豚鼠进行屈光度、眼轴的检测,并在相应时间点取视网膜色素上皮-脉络膜复合体组织用高效液相色谱分析仪检测其RA的含量,用Real-time PCR技术检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA含量,Western blot技术检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的蛋白含量,同时利用免疫荧光技术观察其表达部位。结果：1、屈光度和眼轴变化：随着离焦时间的延长,A组豚鼠双眼屈光度均呈正视化方向发展,眼轴呈正常生长发育速度增长,各时间点双眼屈光度、眼轴长度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B组实验眼呈明显近视漂移,离焦第14天时诱导出相对近视约4.70D,实验眼与自身对照眼屈光度比较差异均有统计学意义(P<0.05)；实验眼相对自身对照眼眼轴增长速度加快,离焦第14天时实验眼(8.18±0.09mm)与自身对照眼(7.68±0.06mm)眼轴长度比较差异最大,有统计学意义(P<0.05)。各时间点正常组与自身对照眼比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2、视黄酸表达变化：视黄酸在豚鼠实验眼视网膜色素上皮-脉络膜复合体上的表达随离焦时间延长而上调,实验眼在离焦第14天表达最高,表达量为137.85±1.02ng/100mg,其与自身对照眼(12.67±0.40ng/100mg)比较差异有统计学意义(P<0.05)。各时间点正常组与自身对照眼比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3、紧密连接蛋白表达变化：紧密连接蛋白ZO-1、Occludin在豚鼠实验眼视网膜色素上皮-脉络膜复合体中的mRNA和蛋白表达均随离焦时间延长而上调,在离焦第14天表达最高,其与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点正常组与自身对照眼比较差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测显示ZO-1、Occludin主要表达于RPE-脉络膜复合体组织的RPE层,其荧光表达结果变化趋势与Real-time PCR和Western Blot检测结果相符。结论：通过给豚鼠佩戴-6.00D凹透镜可以成功建立离焦型近视模型；视黄酸在豚鼠离焦型近视的发展过程中表达上调；紧密连接蛋白ZO-1、Occludin随离焦时间延长表达上调,可能参与了近视的形成和发展。第二章RA受体拮抗剂LE540对豚鼠离焦型近视眼视网膜色素上皮-脉络膜复合体中视黄酸和紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的影响目的：观察LE540对豚鼠离焦型近视眼视网膜色素上皮-脉络膜复合体中视黄酸以及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达的影响,探讨视黄酸与紧密连接蛋白ZO-1、Occludin之间可能的调控关系。方法：取3周龄三色豚鼠(体重约150-180g)90只(雌雄不限),随机分为A组：正常组(n=15)：豚鼠双眼均不佩戴镜片,且不予任何药物干预；B组：离焦组(n=15),豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透镜,左眼均不佩戴镜片,双眼均不予任何药物干预；C组：阴性对照组(n=15),豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透镜,同时予玻璃体腔内注射PBS5μL；D组：药物干预组(n=45),豚鼠右眼均佩戴-6.00D凹透镜,同时予玻璃体腔内注射不同浓度RA受体拮抗剂LE540,根据LE540注射的不同浓度将D组分为D1组：10μM注射组(n=15)；D2组：501μM注射组(n=15)；D3组：100μM注射组(n=15)。以上各组左眼均为自身对照眼。在实验前、实验第3天、第7天、第14天对以上各组豚鼠进行屈光度、眼轴的检测,并在相应时间点取视网膜色素上皮-脉络膜复合体用高效液相色谱分析仪检测其RA的含量,在D1、D2、D3组中根据视网膜色素上皮复合体中RA含量的变化及对屈光度和眼轴长度的影响,选择药物干预后对豚鼠离焦型近视影响最明显的组别作为D组,运用Real-time PCR技术检测A、B、C、D组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA含量,Western blot技术检测各组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的蛋白含量,同时利用免疫荧光技术观察其表达部位及表达强度。结果：1、屈光度和眼轴变化：A组豚鼠双眼屈光度均呈正视化发展,双眼眼轴呈正常生长发育速度增长,各时间点双眼屈光度、眼轴长度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B组豚鼠右眼屈光度呈明显近视漂移,右眼相对左眼眼轴增长速度加快,实验第7天、第14天右眼分别与正常组以及左眼屈光度及眼轴比较均有统计学差异(P<0.05)；C组双眼屈光度及眼轴变化与B组一致,比较差异无统计学意义(P>0.05)；D组随离焦时间的延长,豚鼠各组右眼屈光度近视漂移、眼轴增长趋势随LE540注射浓度的不同均被不同程度抑制,其中在D2(50μtM)组抑制趋势最为明显。而各时间点自身对照眼屈光度和眼轴与正常组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2、LE540对视网膜色素上皮-脉络膜复合体中RA表达的影响：A组豚鼠双眼RA表达在各时间点均无明显差异,比较无统计学意义(P>0.05)。B组豚鼠右眼RA随离焦时间延长表达上调。C组豚鼠右眼RA表达变化与B组表达变化趋势一致,比较差异无统计学意义(P>0.05)。D组豚鼠右眼玻璃体腔注射不同浓度RA受体拮抗剂LE540后,各组RA表达上调趋势随LE540注射浓度的不同均受到不同程度抑制,其中D2组抑制作用最明显。各时间点自身对照眼视黄酸表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3、LE540对视网膜色素上皮-脉络膜复合体中紧密连接蛋白的影响：A组豚鼠双眼紧密连接蛋白ZO-1、Occludin随离焦时间延长无明显变化。B组豚鼠右眼紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表达随离焦时间延长而上调,左眼自身对照眼表达均无明显变化。C组豚鼠双眼紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达变化与B组相近。D组豚鼠右眼玻璃体腔注射不同浓度RA受体拮抗剂LE540后,各组紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表达上调趋势受到明显抑制。免疫荧光检测显示ZO-1、Occludin主要表达于RPE-脉络膜复合体组织的RPE层,其荧光表达结果变化趋势与Real-timePCR和Western Blot检测结果相符。结论：玻璃体腔内注射LE540能有效的抑制豚鼠离焦型近视眼的发展；RA可能通过调控RPE-脉络膜复合体中紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的变化从而参与对近视的调控。图9幅,表6个,参考文献66篇。