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花青素是植物界中最大的水溶性色素家族,也是类黄酮类家族中的一员。在植物体内,花青素充当着响应生理和环境变化的保护机制,有利于植物应对各种生物和非生物胁迫。花青素还是一种天然的抗氧化剂,能够保护人体免受自由基等有害物质的伤害,并且在增强血管弹性、预防心脑血管疾病、保护肝脏等方面有着重要的作用。此外,花青素作为一种天然无害色素,在食用色素开发中有着广泛的应用前景。在模式植物、花卉以及果树中花青素的合成及转录调控机制已研究得较为清楚,但是关于茶树花青素代谢途径转录水平的调控机制及转录因子的作用机理尚不明确。本文以高花青素含量茶树品种“紫娟”(Camellia sinensis var.assamica,cv.Zijuan)为材料,通过转录组测序和qRT-PCR找到了四个与类黄酮类合成相关的MYB转录因子。其中CsAN1的表达量与“紫娟”中花青素的含量呈极显著的相关性,因此我们对其做了进一步的功能验证,结果如下:1.以“紫娟”叶片cDNA为模板,克隆了CsAN1、CsGL3、CsEGL3以及Cs TTG1的全长,并对这几个基因的氨基酸序列进行分析和聚类。其中CsAN1具有R2R3-MYB转录因子的典型结构特征,并具有bHLH的结合位点和调控花青素合成的KPRPR[S/T]F结构域。聚类分析表明CsAN1与中华猕猴桃中调控花青素合成基因AcMYB110的相似性最高,达到58%。2.CsAN1转化本氏烟草促进花青素的积累为了检测CsAN1在植物体的功能,构建了35S::CsAN1超表达载体转化本氏烟草。CsAN1异位表达促进了烟草叶片花青素的积累,并导致花青素合成结构基因上调表达,这说明CsAN1参与植物花青素的合成。3.CsAN1具有转录激活功能并能结合到CsLDOX1和CsLDOX2的启动子上反式激活和酵母单杂交实验结果表明:CsAN1具有自主激活功能,并且能结合到花青素合成关键基因CsLDOX1和Cs LDOX2的启动子上。这说明CsAN1能参与调控茶树花青素的合成。4.CsAN1是MBW复合物的成员酵母双杂交与双分子荧光互补实验结果表明:CsAN1与CsGL3、CsEGL3互作,但不与CsTTG1互作,而CsTTG1也能与CsGL3、CsEGL3互作,这暗示暗示了茶树中也CsAN1、CsGL3、CsEGL3和CsTTG1可能形成MBW存在有MYB、bHLH和WD40重复蛋白形成的MBW三元复合物形式转录调控功能。5.MBW复合物转录调控CsLDOX2启动子的活性双荧光素酶报告系统实验结果显示:CsAN1能提高CsLDOX2启动子的活性。同时共转CsAN1、CsTTG1和CsGL3三个基因,CsLDOX2启动子活性提高更为显著。这也从侧面辅助证明了CsAN1是通过形成MBW复合物调控花青素合成基因的表达。6.“紫娟”CsAN1启动子的低甲基化水平与高花青素含量相关利用hi TAIL PCR技术从四个不同茶树品种中克隆出CsAN1的启动子序列,之后用亚硫酸氢盐测序分析了“紫娟”和其他绿叶茶树品种CsAN1启动子的甲基化水平。结果表明:CsAN1启动子的表达量与甲基化水平呈负相关。用DNA甲基化抑制剂5-aza-dC处理后,能显著提高CsAN1的表达量。7.MBW复合物参与低温和长光照诱导的花青素调控CsAN1、CsTTG1、CsGL3和CsEGL3基因的表达受低温和长光照诱导,低温和长光照处理后的茶树花青素的积累明显增多,CsAN1、CsGL3、CsEGL以及与花青素合成相关基因的表达量也显著上调。