世界范围内肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)大约占85％。在过去20年间，治疗方法不断进步，然而侵袭性非小细胞肺癌患者的预后依旧很差。以顺铂（cisplatin，DDP）等铂类药物为基础的一线化疗方案对于进展期非小细胞肺癌的有效率只有约20％，究其原因是化疗多药耐药(multidrug resistance，MDR)的结果，特别是对顺铂产生耐药。目前，这种MDR的潜在机制尚不清楚。因此，明确MDR分子机制并扰乱其相关信号转导可能是逆转药物抵抗的有效策略。在肿瘤细胞中，顺铂可与DNA结合引起DNA链间和链内交联，DNA空间构象的改变抑制了其复制和转录。这种DNA的损伤可以累及很多信号转导分子，顺铂的耐药可能就与相关信号转导通路的活化有关，如PI3K/Akt信号转导通路、MAPK信号转导通路、p53信号转导通路等。近来发现Wnt/β-catenin信号转导通路可能也与顺铂耐药有关联。迄今为止，Wnt/β-catenin信号转导通路在NSCLC顺铂耐药中的作用及其分子机制还不明确，有待进一步阐明。　　 本研究拟通过观察顺铂处理前后A549、A549/DDP细胞中GSK-3β各种活性形式蛋白的表达及胞内分布，明确其与耐药之间的关系;并通过瞬时干扰GSK-3β及β-catenin的表达，分析活化或阻断Wnt/β-catenin信号转导通路对耐药的影响，旨在探讨由GSK-3β调节的Wnt/β-catenin信号转导通路在A549/DDP细胞顺铂耐药中的作用及分子机制。　　 材料与方法：　　 1、细胞和细胞培养　　 人肺腺癌A549细胞系由中国医科大学病理教研室提供，顺铂耐药A549/DDP细胞系购自中国医学科学院肿瘤研究所。在37℃、5％CO2的孵育条件下，A549、 A549/DDP细胞分别在含有10％胎牛血清的DMEM和RPMI-1640培养液中培养。当细胞融合度达到90％时，用0.25％的胰酶消化传代。　　 2、MTT法检测细胞增殖抑制　　 MTT法检测顺铂对细胞生长的影响。将A549、A549/DDP细胞分别接种于96孔板中并在37℃、5％ CO2的孵育条件下培养。24小时后，20 mM LiC1预处理6小时，再用不同浓度的顺铂处理48小时，加入MTT（终浓度0.5 mg/ml），用酶标仪测量570 nm波长下的吸光度值。用细胞的存活曲线计算顺铂的半数抑制浓度。　　 3、细胞凋亡试验　　 Hoechst33342染色:将处理完的细胞接种于24孔板中，用终浓度5 mg/ml的DNA特异性染料Hoechst33342染色，立即用荧光显微镜的蓝色荧光滤片进行观察。　　 流式细胞检测分析:处理后，收集细胞按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的操作流程进行检测。凋亡和坏死的细胞被流式细胞计数仪定量并用CellQuest软件分析结果。　　 4、免疫荧光染色　　 先将细胞在4％的多聚甲醛中固定20分钟，再用0.2％ Triton X-100阻断非特异性结合20分钟，后孵育一抗，4℃过夜。PBS洗涤后，室温下孵育荧光二抗2小时。PBS洗涤后DAPI染色，共聚焦显微镜下成像。　　 5、核浆提取物的准备　　 为了检测细胞中GSK-3β的定位，我们使用NE-PER核浆提取试剂盒按照操作流程分离提取细胞中的核蛋白和浆蛋白。　　 6、siRNA转染　　 在6孔板中过夜培养A549/DDP细胞后，用Hiperfect转染试剂分别将siRNA和阴性对照siRNA转入A549/DDP细胞中。转染后，收集一部分细胞用于Western blotting检测蛋白表达，另一部分细胞被顺铂（20μM）处理24小时后用于流式细胞分析和MTT法检测细胞凋亡率和半数抑制浓度。　　 7、蛋白质印迹　　 将含有60μg蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，封闭2小时后于多克隆一抗中4℃孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗室温条件下孵育2小时后ECL显色。　　 8、统计分析　　 数据用(x)±S表示，SPSS13.0软件中的t检验或单因素方差分析进行统计。P＜0.05时统计有显著性差异。　　 结果：　　 1、顺铂对A549、A549/DDP细胞生长和凋亡的影响　　 用逐渐增加浓度的顺铂处理A549、A549/DDP细胞，48小时后，两种细胞均表现出顺铂剂量依赖性的生长抑制，MTT法检测A549/DDP细胞顺铂的IC50值是A549细胞的4.92倍。流式细胞检测结果显示:在A549细胞中，10μM顺铂已使早期凋亡细胞数明显增加，15μM和20μM顺铂可以使早期凋亡细胞数持续保持在较高水平。相反，在A549/DDP细胞中，10μM或15μM顺铂仅能使早期凋亡率轻度升高，直至20μM顺铂才可以引起高比例细胞凋亡。　　 2、A549、A549/DDP细胞中GSK-3β、p-GSK-3βser9和p-GSK-3βtyr216的表达　　 Western blot法检测发现:A549/DDP细胞中总GSK-3β和p-GSK-3βser9的水平明显高于A549细胞，而A549/DDP细胞中p-GSK-3βtyr216的水平低于A549细胞。A549/DDP细胞浆中总GSK-3β表达与A549细胞几乎是相等的，而A549/DDP细胞浆中p-GSK-3βser9表达明显升高，相反，A549/DDP细胞浆中p-GSK-3βtyr216显著减少。A549/DDP细胞核中总GSK-3β和p-GSK-3βser9表达均比A549细胞明显减少，而两种细胞核中p-GSK-3βtyr216表达几乎相等。　　 3、顺铂对A549、A549/DDP细胞胞浆、胞核中GSK-3β磷酸化的影响　　 Western blot法检测发现:顺铂处理前后，A549、A549/DDP细胞浆中总GSK-3β水平均无明显差异。然而，顺铂处理24小时后，A549/DDP细胞浆中p-GSK-3βser9水平升高，A549细胞浆中p-GSK-3βser9水平降低;相反，A549/DDP细胞浆中p-GSK-3βtyr216水平降低而A549细胞浆中p-GSK-3βtyr216水平升高。同时，顺铂使A549/DDP细胞核中GSK-3β和p-GSK-3βser9表达增加而使A549细胞核中二者的表达减少，而使两种细胞核中p-GSK-3βtyr216表达相似。　　 4、顺铂使A549/DDP细胞Wnt/β-catenin信号转导通路激活而使A549细胞Wnt/β-catenin信号转导通路失活　　 顺铂处理24小时后，免疫细胞荧光法观察到A549细胞中β-catenin主要分布在胞膜和胞浆中，胞核中分布很少，而A549/DDP细胞中β-catenin出现明显的核移位;Western blot法检测到A549细胞中β-eatenin、survivin表达明显下调，而A549/DDP细胞中β-catenin、survivin表达显著上调。　　 5、抑制GSK-3β活性可增强耐药、减少细胞凋亡　　 LiC1预处理6小时后，Western blot法检测到A549、A549/DDP细胞浆中p-GSK-3βser9的水平均明显上调。20 mM LiC1预处理6小时再用顺铂处理48小时后，MTT法检测到A549、A549/DDP细胞顺铂的IC50值均较单独顺铂处理48小时增加，流式细胞检测结果显示两种细胞的早期凋亡率减少，同时，Hoechst33342染色法发现核固缩、核碎裂的比例也随之下降。　　 6、沉默GSK-3β蛋白表达增强Wnt/β-catenin信号转导通路介导的耐药　　 用siRNA抑制GSK-3β的表达可以明显增加A549/DDP细胞顺铂的IC50值，并显著降低顺铂诱导的早期凋亡率，另外，核固缩、核碎裂的数量也明显减少。同时，Western blot法检测到GSK-3β siRNA干扰导致了β-catenin和survivin的表达显著上调。　　 7、沉默β-catenin蛋白表达减弱Wnt/β-catenin信号转导通路介导的耐药　　 用siRNA抑制β-catenin的表达可使A549/DDP细胞顺铂的IC50值明显减少，并使顺铂诱导的早期凋亡率显著升高，另外，核固缩、核碎裂的数量也明显增加。同时，Western blot法检测到β-catenin siRNA干扰导致了β-catenin和survivin的表达显著下调。　　 结论：　　 1、顺铂引起A549/DDP细胞浆中GSK-3β活性减弱而A549细胞浆中GSK-3β活性增强。　　 2、顺铂引起A549/DDP细胞中Wnt/β-catenin信号转导通路激活而A549细胞中Wnt/β-catenin信号转导通路受抑。　　 3、胞浆中GSK-3β活性下降介导Wnt/β-catenin信号转导通路激活，其靶基因survivin高表达所致细胞凋亡受抑是A549/DDP细胞耐药的重要机制。