感染性疾病仍然严重威胁着人们的生命健康。人类嗜T淋巴细胞病毒(humanTlymphotropicvirus，HTLV)是唯一从人体肿瘤中分离的RNA病毒(有Ⅰ、Ⅱ两型)，它与人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiendyvirus，HIV)一样同属逆转录病毒，也是通过血液、性接触和母婴传播。因这些病毒能引起癌症和艾滋病而受到世人瞩目。自1980年分离出HTLV病毒以来，已报道HTLV-Ⅰ可以引起成人T淋巴细胞白血病(adultT-cellleukemia，ATL)和脊髓病变。而在眼部，HTLV-Ⅰ感染能导致以葡萄膜视网膜病变为主的多种眼部疾病。HTLV-Ⅰ感染的眼部病变可以是独立于全身的病变，也可伴发或先于全身病变发生。 HTLV-Ⅰ不含有任何已知的癌基因，也未发现其在某一原癌基因附近的固定的整合位置。该病毒的Tax基因产物Tax蛋白是反式作用的转录激活因子，含有多个活性区域，在病毒复制中起反式激活作用，使病毒从长末端重复序列开始转录。也可同时作用于多种细胞基因/蛋白，导致细胞功能异常。因此Tax蛋白在细胞转化发生癌症的过程中起了很重要的作用。 葡萄膜视网膜病变时，视网膜组织中的Müller细胞是眼部参与炎症防御的关键细胞。Müller细胞及其突起广泛分布于视网膜内各类神经元胞体和神经纤维之间，与神经元的关系极为密切，在视网膜的整个功能活动中起着重要作用。研究发现将视网膜胶质细胞与含病毒的白细胞共同培养，可致使胶质细胞感染HTLV-Ⅰ病毒，表达Tax和gag病毒蛋白。这些提示眼部HTLV-Ⅰ感染可能因为感染炎症、免疫介导和增生性疾病而产生病变，即除白细胞的浸润增生外，HTLV-Ⅰ病毒在视网膜细胞中(如胶质细胞)繁殖，并影响宿主细胞的各种活性因子的表达及活性，从而产生病理效应。 基于此，本研究中我们针对HTLV-Ⅰ病毒的调节因子Tax基因/蛋白，通过细胞外结合和细胞内表达两种途径分析研究Tax蛋白在Müller细胞中的结合和/或效应靶蛋白分子，以及Tax蛋白对细胞的影响，找出Müller细胞中Tax效应的特征性蛋白质分子，为探索病毒调节蛋白Tax在HTLV-Ⅰ相关眼病中的作用及分子机制奠定基础。 1.HTLV-ⅠTax蛋白与Müller细胞蛋白细胞外结合实验研究 目的：分离并鉴定细胞外Tax蛋白在Müller细胞中的结合和/或效应靶蛋白分子。 方法：1、大肠杆菌中诱导表达并提取纯化GST-Tax融合蛋白；2、细胞外GST-Tax融合蛋白与Müller细胞蛋白结合，谷胱甘肽琼脂糖凝胶4珠子(glutathionsepharose4beads，GS4B)下拉(pull-down)；3、应用二维凝胶电泳及质谱和生物信息学以及免疫印迹等方法对结合蛋白进行鉴定。 结果：通过二维凝胶电泳根据等电点和分子量的不同将蛋白分开，再以质谱和生物信息学途径对蛋白进行鉴定。找到并鉴定了10个差异蛋白质{1.延长因子1α，similartoeukaryotictranslationelongationfactor1alpha；2.碳酰还原酶，carbonylreductase(NADPH)；3.延长因子1γ，Eukaryotictranslationelongationfactor1gamma；4.微管素α6，tubulinalpha6；5.ATP合酶β亚基，ATPsynthasebetasubunit；6.葡萄糖调节蛋白，Glucoseregulatedprotein，58kDa；7.未知蛋白，Unknown(proteinforIMAGE：3538275)[Homosapiens]；8.层粘连蛋白，laminin-bindingprotein[Homosapiens]；9.胰岛素样生长因子结合蛋白3，insulin-likegrowthfactorbindingprotein-3；10.烯醇化酶1ENO1，Enolprotein；}。进一步经下拉纯化，用抗ENO抗体进行免疫印迹，观察到ENO与Tax蛋白能相互结合。 结论：1、从Müller细胞中初步分离鉴定出与Tax蛋白结合和/或效应靶蛋白分子；2、在细胞外Tax蛋白能够与ENO相结合，ENO为Tax蛋白在Müller细胞中的结合/效应靶蛋白分子。 2.HTLV-ⅠTax蛋白在Müller细胞内实验研究 目的：观察Tax蛋白对细胞生长的影响及进一步验证Müller细胞中与HTLV-ⅠTax蛋白结合和/或效应靶蛋白分子。 方法：重组质粒pc-Tax转染Müller细胞后，1、观察Müller细胞形态学变化；2、激光共聚焦显微镜观察转染效率；3、细胞免疫化学及细胞免疫荧光化学法检测Müller细胞内Tax蛋白的表达；4、免疫印迹法检测Müller细胞内Tax蛋白的表达；5、MTT比色法检测Müller细胞的活力；6、流式细胞仪分析Müller细胞周期；7、免疫共沉淀法验证Müller细胞内Tax蛋白结合和/或效应靶蛋白分子。 结果：重组质粒pc-Tax转染Müller细胞后，1、可见部分细胞皱缩或死亡、脱落，飘浮于培养液中，其余细胞胞浆内颗粒增多；2、部分Müller细胞内可见GFP的绿色荧光；3、部分Müller细胞胞浆内可见Tax蛋白表达，呈阳性棕色反应。激光共聚焦显微镜观察可见部分Müller细胞胞浆内发绿色荧光；4、免疫印迹检测可见Tax蛋白特异性的阳性印迹条带；5、Müller细胞活力受到影响；6、Müller细胞周期受到影响；7、免疫共沉淀法可见ENO的特异性阳性印迹条带。 结论：1、Tax蛋白能够在Müller细胞内表达；2、Tax蛋白对Müller细胞的活力及细胞周期有一定影响；3、Tax蛋白能够与细胞内的ENO相结合，ENO为Tax蛋白在Müller细胞中的结合/效应靶蛋白分子。