AOC和ipt基因转录融合转化热研5号柱花草

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土壤盐渍化是一个世界性问题,严重影响着人类对土地充分有效的利用。本研究使用农杆菌介导法,通过LBA4404农杆菌,将外源耐盐基因AOC转录融合植物细胞分裂激素合成关键酶基因ipt导入热研5号柱花草基因组;探讨了热研5号柱花草(Stylosanthes guianensis cv. Reyan No.5)的组织培养条件和基因转化的条件,包括:热研5号柱花草最佳外植体选择;热研5号柱花草愈伤组织诱导培养基的选择;基因转化中的抗生素选择;农杆菌菌种、菌液浓度和侵染时间对基因转化的影响;乙酰丁香酮对基因转化的影响;共培养对基因转化的影响。获得了近500株在抗性培养基上能生长的pVKH-AOC-ipt-pA转基因柱花草,并通过基因组PCR检测,RT-PCR对部分转基因植株进行了分子检测,结果如下:1)热研5号柱花草最佳愈伤诱导培养基为:MS+4 mg/L 6-BA+2 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+8.0 g/L琼脂粉,pH 6.0;芽分化培养基为MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+8.0 g/L琼脂粉,pH 6.0;生根培养基为MS固体培养基或者1/2 MS固体培养基;最佳外植体为刚出芽的子叶。2)利用已经建立好的植株再生体系,优化了农杆菌介导的热研5号柱花草基因转化的多种因素。结果表明,农杆菌LBA4404对热研5号柱花草的浸染能力最强;农杆菌菌液浓度OD600值在0.6左右时,浸染子叶10~15 min,在25℃下共培养60 h左右,转化效果最好;侵染过程中使用乙酰丁香酮对转化效率没有影响。3)探讨了柱花草组培苗的移栽条件,结果表明,移栽前短期的开盖炼苗有利于移栽成活率;柱花草组培苗的移栽过程中,基质和组培苗的培养时间都不严格,最重要的是移栽后保湿、遮光的管理,可以明显提高移栽成活率。4)利用该优化转化体系,将耐盐基因AOC-ipt导入热研5号柱花草基因组,并获得近500株在抗性培养基中能生长转基因再生植株。经过进一步PCR和RT-PCR分子检测,已获得了有14个在mRNA水平上能转录的转基因株系;已成功地将这14个转基因株系移栽到沙土中。
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