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第一部分 烟草烟雾提取物及CD40-CD40L通路对小鼠树突状细胞诱导GD4+T细胞分化Th1/Th2的影响目的:本研究旨在观察烟草烟雾提取物(CSE)对树突状细胞(DCs)诱导分化Th1/Th2细胞效应的影响,同时探讨CD40-CD40L信号通路在其诱导分化中的作用,进一步理解烟草烟雾暴露下树突状细胞及效应性T细胞免疫失衡在慢性阻塞性肺疾病发病中的作用,为临床防治提供参考。方法:SPF级雄性balb/c小鼠约50只,鼠龄6-8周龄,体重22-25g,无菌条件下分离小鼠骨髓来源单个核细胞,在体外用RPMI1640培养基联合10%胎牛血清、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)(10ng/ml)、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(40ng/ml)联合培养诱导分化成DCs(通过流式细胞仪检测DCs表面标记CD11C确定DCs);并将DCs随机分成4个组(空白对照组、CSE干预组、CD40拮抗对照组和CD40拮抗+CSE干预组);并采用免疫磁珠阴性分选法分选出同批balb/c小鼠脾脏来源CD4+T淋巴细胞,与DCs共培养(按1:10比例),并将其随机分成4个组:共培养空白对照组(共培养对照组);CSE干预共培养组;CD40拮抗共培养对照组;CD40拮抗+CSE干预共培养组。同时将CD4+T细胞分为4个组作为对照:包括空白对照组(T细胞对照组);CSE干预CD4+T细胞组(CSE干预T细胞组);CD40拮抗剂干预CD4+T细胞对照组(CD40拮抗T细胞对照组);CD40拮抗+CSE干预CD4+T细胞组(CD40拮抗+CSE干预T细胞组)。CSE干预组和CD40拮抗+CSE干预组加入烟草烟雾提取物(终浓度为1%),CD40拮抗+CSE干预组和CD40拮抗对照组加入CD40拮抗性抗体(终浓度为10μ g/ml),以上各组细胞干预后继续培养孵育24小时(采用无血清培养基培养),收获的细胞中,单独DCs培养4个组行流式细胞技术检测DCs表面共刺激分子CD40的表达及荧光定量PCR检测CD40mRNA的表达;单独CD4+T细胞培养和DCs与T细胞共培养各组分别通过流式细胞技术检测分析各组Th1((CD4+IFN-γ+)和Th2(CD4+IL-4+)细胞的百分比,荧光定量PCR检测各组T-bet mRNA和GATA3 mRNA的表达,液相芯片检测各组细胞上清液细胞因子 IFN-Y,IL-4,IL-10 和 IL-12 的浓度。结果:1、流式细胞术检测结果:(1)与对照组相比,CSE干预组CD40升高(P<0.01);CD40拮抗+CSE干预组的CD40比CSE干预组的降低(P<0.05);(2)CSE干预共培养组的Th1百分比均较T细胞对照组、CSE干预T细胞对照组和共培养对照组的升高(P<0.05);而CSE干预共培养组的Th2百分比均较T细胞对照组、CSE干预T细胞组和共培养对照组的降低(P<0.05);(3)CD40拮抗+CSE干预共培养组的Th1比CSE干预共培养组的降低(P<0.05);而CD40拮抗+CSE干预共培养组的Th2与CSE干预共培养组比较,差异无明显统计学意义(P>0.05);2、荧光定量PCR检测结果:(1)与对照组相比,CSE干预组CD40mRNA表达升高(P<0.05);CD40拮抗+CSE干预组的CD40mRNA比CSE干预组的降低(P<0.05);(2)CSE干预共培养组T-bet mRNA均较T细胞对照组、共培养对照组和CSE干预T细胞组增高(P<0.05);而CSE干预共培养组GATA-3 mRNA与共培养对照组、T细胞对照组及CSE干预T细胞组比较降低(P<0.05);(3)CD40拮抗+CSE干预共培养组T-bet mRNA较CSE干预共培养组降低(P<0.05);而CD40拮抗+CSE干预共培养组GATA-3比较CSE干预共培养组无明显统计学差异(P>0.05);3、液相芯片检测结果:(1)CSE干预共培养组IFN-γ、IL-12浓度较T细胞对照组、CSE干预T细胞组和共培养对照组的升高(P<0.05);而CSE干预共培养组的IL-4和IL-10较T细胞对照组、CSE干预T细胞组和共培养对照组的降低(P<0.05);(2)CD40拮抗+CSE干预共培养组的IFN-γ、IL-12比CSE干预共培养组的降低(P<0.05);而CD40拮抗+CSE干预共培养组的IL-4和IL-10与CSE干预共培养组比较无统计学差异(P>0.05);结论:烟草烟雾暴露环境下可以诱导小鼠髓样DCs对Th1(CD4+IFN-γ+)细胞的分化;在烟草烟雾暴露条件下存在Th1/Th2细胞分化的失衡;CD40-CD40L通路参与烟草烟雾暴露下DCs诱导CD4+T细胞分化为Th1细胞,并在其中起重要作用。第二部分 红霉素干预对烟草烟雾提取物暴露下小鼠树突状细胞诱导CD4+T细胞分化为Th 1/Th2的影响目的:本研究旨在观察红霉素(Erythromycin,EM)干预对烟草烟雾暴露下 DCs 诱导 CD4+T 细胞分化 Th1(CD4+IFN-Y+)和 Th2(CD4+IL-4+)细胞的影响,为慢性阻塞性肺疾病的临床防治提供参考依据。方法:SPF级雄性balb/c小鼠约50只,鼠龄6-8周龄,体重22-25g,无菌条件下分离小鼠骨髓来源单个核细胞,在体外用RPMI1640培养基联合10%胎牛血清、重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)(10ng/ml)、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(40ng/ml)联合培养诱导分化成DCs(通过流式细胞仪检测DCs表面标记CD11C确定DCs)并随机将DCs分成4个组(空白对照组、CSE干预组、EM干预对照组和EM+CSE干预组),并分离同批balb/c小鼠脾脏,采用免疫磁珠阴性分选法分选出脾脏来源CD4+T淋巴细胞,与DCs共培养(按1:10比例),并将其随机分成4个组:共培养空白对照组(共培养对照组);CSE干预共培养组;EM干预共培养对照组;EM+CSE干预共培养组。同时将CD4+T细胞分为4个组作为对照:包括CD4+T细胞空白对照组(T细胞对照组);CSE干预CD4+T细胞组(CSE干预T细胞组);EM干预CD4+T细胞对照组(EM干预T细胞对照组);EM+CSE干预CD4+T细胞组(EM+CSE干预T细胞组)。CSE干预组和EM+CSE干预组加入烟草烟雾提取物(终浓度为1%),EM干预组和EM干预对照组加入EM(终浓度为100 μ g/ml),以上各组细胞干预后继续培养孵育24小时(采用无血清培养基培养),收获的细胞中,单独DCs培养4个组行流式检测DCs表面共刺激分子CD40表达及荧光定量PCR检测CD40mRNA的表达;单独CD4+T细胞培养和DCs与T细胞共培养各组分别通过流式细胞技术检测分析各组Th1(CD4+IFN-Y+)和Th2(CD4+IL-4+)细胞的百分比,荧光定量PCR检测各组T-bet mRNA和GATA3 mRNA的表达,液相芯片检测各组细胞上清液细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-10和IL-12的浓度。结果:1、流式细胞术检测结果:(1)与对照组相比,CSE干预组CD40升高(P<0.01);EM+CSE干预组的CD40比CSE干预组的降低(P<0.05);(2)EM+CSE干预共培养组的Th1细胞百分比较CSE干预共培养组的下降(P<0.05);而EM+CSE干预共培养组的Th2细胞百分比与CSE干预共培养组比较无明显差异(P>0.05);2、荧光定量PCR检测结果:(1)与对照组相比,CSE干预组DCs细胞CD40mRNA升高(P<0.05);EM+CSE干预组的CD40mRNA比CSE干预组的降低(P<0.05);(2)EM+CSE干预共培养组T-bet mRNA较CSE干预共培养组的下降(P<0.05);而EM+CSE干预共培养组的GATA-3 mRNA与CSE干预共培养组比较无明显差异(P>0.05);3、液相芯片检测结果:EM+CSE干预共培养组IFN-γ、IL-12浓度较CSE干预共培养组的下降(P<0.05);而EM+CSE干预共培养组IL-4浓度与CSE干预共培养组比较有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05);EM+CSE干预共培养组的IL-10较CSE干预共培养组的升高(P<0.05);结论:红霉素在烟草烟雾暴露环境下诱导DCs对CD4+辅助性T细胞分化过程中起免疫调节重要作用,可抑制DCs诱导的CD4+T细胞分化Th1细胞,主要是通过抑制CD40-CD40L信号通路起作用。