石刁柏雄株离体再生体系的建立及生理生化研究

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本实验以石刁柏雄株嫩茎带芽茎段为外植体,诱导腋芽生成芽丛建立离体培养体系,比较系统地研究了石刁柏雄株离体丛生芽分化增殖的适宜培养基、不定根诱导生长的关键因子以及再生植株移栽成活的影响因素;首次研究了石刁柏离体再生体系建立过程中一系列的生理生化变化,提出了根、芽形态发生的早期指标,并从组织形态学上对离体不定根发生机制作了初步探讨。 实验研究结果表明,KT和6-BA对芽丛均具有诱导作用,KT有利于提高不定芽分化率及分化芽数;BA使不定芽生长粗壮;与NAA配合使用促进芽的正常生长。 激素、培养基、培养方式及外植体部位和世代都是离体生根的影响因素。在根原基诱导培养阶段,激素种类和浓度是影响生根的关键。1.0mg/L PP333处理的生根率最高,达到81.58%,单株苗数也最多;0.5mg/L S3307处理的生根率也达到了80%,且促进根系的生长及健壮植株的形成;1.0mg/L IBA诱导的生根率在70%左右;BR作用浓度较低,0.01mg/L处理的生根率接近50%,但同时生成大量愈伤,严重影响生根率及根质的提高。正交试验结果表明,PP3331.0mg/L+IBA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+KT0.05mg/L是诱导生根的最佳激素处理组合。 以大量元素减半的1/2MS培养基为诱导阶段的基本培养基的生根效果显著好于MS培养基;诱导培养有一个最适的诱导时间,7~9天的诱导效果好,并以诱导9天的平均生根率为最高;以茎尖为外植体较之茎段中部更易于生根;继代3次的芽丛生根率高于继代1次的芽丛。实验结果显示,各因子优化组合,试管苗在培养40天内生根率可达80%以上,且不定根均从茎段下部直接长出,不含愈伤组织,移栽成活率很高。 生理生化研究结果显示,在石刁柏离体根诱导与生长过程中,过氧化物酶活性呈波动上升趋势,并在培养第7、25天出现活性峰,峰值为0.909μmol·min-1·mg-1Protein、0.772μmol·min-1·mg-1Protein,它们分别与根原基形成期及抽生新芽前期相对应,体现了POD在形态发生中的指示作用。实验结果还表明,非特异性酯酶、苯丙氨酸解氨酶的活性以及可溶性蛋白质、核酸、内源多胺的含量在培养过程中发生了与POD活性类似的起伏变化,都出现了两个峰值,且出现时间均与两个时期基本吻合;此外,不同发育阶段POD、NSE同工酶的谱带也发生显著变化,在活性达到峰值的同时出现了新的酶带。分析认为,这些生理生化变化的峰值以及新酶带是离体不定根诱导发生及试管苗新芽抽生之前所特有的,可以作为石刁柏试管苗形态发生的早期生理生化指标。 本文还从组织形态学方面研究了离体培养下不定根发生过程的细胞学变化,对其起源问题进行了初步的探讨,为研究石刁柏离体生根机制奠定了一定的理论基础。
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