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EBV早期基因BHRF1是近年来确认的一种新的EBV致癌基因,体外可引起细胞转化,可能代替LMP1在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。EBV只感染人及高等灵长类动物,缺乏合适的体外复制增殖体系,转基因小鼠能很好地模拟体内的生理、病理环境,因此建立BHRF1转基因小鼠有助于整体水平明确BHRF1抗凋亡机制以及与bcl-2功能的异同,为深入研究BHRF1的生物学特性以及探讨EBV致瘤机制提供理想的动物模型。目的构建稳定表达BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠。方法①.培养淋巴瘤细胞系B95-8细胞,TRIzol法提取其RNA,反转录合成cDNA,作为PCR模板;采用Primer premier 5.0软件设计BHRF1基因的特异性引物,且在上下游引物的5’端分别引入EcoRⅠ和EcoRⅤ双酶切位点及保护碱基,应用RT-PCR扩增BHRF1基因。②.将目的基因BHRF1与pMD18-T载体连接,构建成pMD18-T-BHRF1。③.分别用EcoRⅠ和EcoRⅤ双酶切pMD18-T-BHRF1和pcDNA(TM)3.1(+)载体,切取目的基因BHRF1和pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。④.用NruⅠ和DraⅢ双酶切pcDNA3.1-BHRF1,酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳,然后QIAquick胶回收纯化试剂盒回收含有CMV启动子、插入的目的基因BHRF1及BGHpolyadenylation的DNA片段,然后溶于显微注射缓冲液(pH7.4)中,注射浓度为3ng/μL。⑤.首先结扎雄性小鼠,待恢复后制备假孕小鼠,同时制备供卵小鼠,处死供卵小鼠取受精卵,将含目的基因的DNA片段用显微注射法注入小鼠受精卵原核,进而将导入转基因的受精卵移植至假孕动物输卵管,发育产子鼠。⑥.提取首建转基因小鼠鼠尾组织DNA,PCR鉴定有无目的基因的整合。结果①.RT-PCR扩增获得699bp的BHRF1目的基因片段,并与pcDNA3.1质粒载体连接,经PCR检测、限制性内切酶鉴定以及测序证实目的基因BHRF1正确插入pcDNA3.1质粒载体,成功构建重组质粒pcDNA3.1-BHRF1。②.NruⅠ和DraⅢ双酶切重组质粒pcDNA3.1-BHRF1,电泳结果可观察到约2000bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段以及约4100bp载体片段,将CMV+BHRF1+polyADNA片段回收纯化,用于显微注射。③.选择超排小鼠数20只,见栓数量18只,选取健康受精卵480枚,通过显微注射的方法,将纯化的CMV+BHRF1+polyADNA片段分别注射入480枚小鼠受精卵,短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只怀孕,产下74只子鼠。④.PCR检测鼠尾组织DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因首建鼠,有望为进一步研究EBV早期基因BHRF1的生物学特性、深入探讨BHRF1在EBV相关肿瘤发生发展的作用提供了理想的动物模型。