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酒精相关的肌病的特点是严重的骨骼肌生化和结构的变化,肌萎缩是其主要的临床表现之一。酒精在机体的代谢过程中产生大量的活性氧(ROS)和自由基,引起细胞内的氧化应激和脂质过氧化。泛素连接酶E3是骨骼肌萎缩中的关键酶,目前已将泛素连接酶E3s中的Atrogin-1作为检测肌萎缩发生的早期生化标记物。本实验采用酒精作用于C2C12成肌细胞建立体外急性酒精中毒性肌病模型,运用活性氧检测和Western Blot检测技术,观察酒精处理C2C12成肌细胞前后ROS、Atrogin-1、P38蛋白的变化,及给予各个MAPK通路的抑制剂后Atrogin-1的表达变化,分析酒精对C2C12成肌细胞的氧化损伤情况和影响Atrogin-1表达的机制。结果显示:酒精(100mM)作用于C2C12细胞2小时后,ROS水平即开始升高,与正常组有显著性差异(P<0.05);在酒精(100mM)作用于细胞2～12小时中,Atrogin-1蛋白水平与对照组相比,均有显著性升高(P<0.05),且在6小时表达最多;酒精(100mM)作用C2C12细胞2小时后,磷酸化蛋白P38水平明显升高,与对照组有显著性差异(P<0.05);加入P38通路的特异性抑制剂SB203580后,与酒精处理组相比,Atrogin-1蛋白水平明显降低。综上所述,酒精可引起C2C12成肌细胞中活性氧产生的增加,诱发氧化应激反应,引起细胞内Atrogin-1蛋白表达增加;并且酒精是通过P38MAPK信号通路引起的Atrogin-1蛋白表达增加。本研究通过体外培养小鼠C2C12骨骼肌成肌细胞,在诱导其分化过程中,观察酒精对骨骼肌细胞的氧化损伤情况及Atrogin-1的蛋白表达水平,并探讨其细胞信号转导通路,为探索骨骼肌萎缩的发生机制提供了新的思路。目的:本研究通过体外培养小鼠C2C12骨骼肌成肌细胞,并诱导其分化,观察酒精对骨骼肌细胞的氧化损伤情况及Atrogin-1蛋白的表达影响,研究在C2C12成肌细胞急性酒精中毒性肌病的模型中,酒精对Atrogin-1蛋白水平的影响,并探讨其中涉及的细胞信号转导通路,为抑制肌肉萎缩提供新的治疗方法。方法:1.通过更换增值培养基为分化培养基,诱导C2C12成肌细胞的分化。2.通过CCK-8法检测细胞活性,确定酒精能够引起细胞损伤的最适作用浓度。3.酒精(100mM)处理 C2C12 细胞 Oh、2h、4h、6h、8h 后,利用 DCF 法和倒置显微镜观察不同组之间细胞内的ROS水平。4.酒精(100mM)分别作用于C2C12细胞不同时间点,即:Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h,然后检测各组之间 Atrogin-1、P-P38、P-JNK、P-ERK 蛋白的表达水平,以观察酒精(100mM)不同的处理时间对C2C12细胞中Atrogin-1蛋白的表达及各个MAPK细胞信号转导通路的磷酸化有无影响。5.预先加入(不加)各个MAPK细胞信号转导通路的抑制剂:SB203580(P38抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂),然后加酒精(100mM)处理C2C12细胞6小时后,用Western Blot技术检测不同组Atrogin-1蛋白的表达变化,以研究酒精对Atrogin-1蛋白的影响与各个MAPK细胞信号转导通路之间的关系。结果:1.通过更换分化培养基的方法,诱导C2C12成肌细胞分化为肌管:在C2C12成肌细胞增殖达到80～90%融合时,将增殖培养基换为分化培养基,隔天换液,观察到在第5～7天时分化达高峰。2.CCK-8法细胞活性检测结果显示:酒精(0～200mM)对于C2C12细胞的活性无影响。3.酒精(100mM)作用于C2C12细胞2小时后,细胞内的ROS水平即有升高,在4小时达到高峰,与正常组对比有显著性差异(P<0.05)。4.在酒精(100mM)作用于C2C12细胞2-12小时中,Atrogin-1蛋白表达水平与对照组相比,均有显著性升高(P<0.05),且在6小时表达最高。5.酒精(100mM)作用C2C12细胞2小时后,磷酸化蛋白P38水平明显升高,与对照组对比有显著性差异(P<0.05);加入其抑制剂SB203580后,与酒精组相比,Atrogin-1蛋白水平明显降低。结论:1.酒精(100mM)可引起C2C12细胞中活性氧产生的增加,诱发氧化应激反应,引起细胞内Atrogin-1蛋白表达增加。2.酒精可通过P38 MAPK信号通路引起C2C12细胞内Atrogin-1蛋白表达增加。