喜树碱(Camptothecin, CPT)是公认的有效抗肿瘤药,药理研究证实,喜树碱主要是抑制肿瘤细胞在DNA复制过程中拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase I, Topo-Ⅰ)的活性而发挥抗肿瘤作用,即主要在细胞周期S期起作用。神经元是高度分化的细胞,细胞无分裂增殖能力,不存在DNA复制过程,即细胞周期只停留在G1期,因此,理论上喜树碱对神经元是无细胞毒性作用。然而,不断有临床报道,喜树碱具有一定的神经系统毒副作用。恶性肿瘤病人在化疗期间或化疗后常出现神经系统症状,如一过性构音障碍、肢体的共济失调等,特别是长期接受化疗患者更易发生。目前喜树碱对神经系统损伤的具体机制尚不明确。神经元虽是高度分化的细胞,但大脑常处于高氧的环境。因此,神经元中DNA转录的发生较其他细胞更为活跃。喜树碱的神经毒性机制是否与DNA的转录过程有关,喜树碱是否会通过抑制转录过程中Topo-Ⅰ活性,引起DNA单链断裂,大量单链断裂DNA的积累,影响了整个DNA的稳定,最终导致DNA双链断裂,造成神经元凋亡。为此,本实验利用原代培养小鼠神经元,观察喜树碱及加转录抑制剂干预后神经元的DNA损伤以及凋亡的诱导作用,以期深入揭示喜树碱中枢神经毒性的内在机制。目的：本实验以原代培养小鼠大脑皮层神经元为切入点,观察喜树碱对神经元活性及凋亡的影响,以期对喜树碱的神经毒性机制进行科学诠释,为该中药更好应用于临床提供实验依据。方法：1.采用原代取材方法获得小鼠大脑皮层神经细胞,进行培养,纯化。2.筛选喜树碱的用药浓度。将培养的神经元分为7组,分别加入不同浓度的喜树碱,终浓度分别为0、2.5、5、10、20、40、80UM,每个浓度设6个复孔,分别培养至12h、24h、48h后,采用CCK-8方法检测细胞的活性。并计算喜树碱的半数抑制浓度(IC50),作为后续实验用药浓度。3.观察喜树碱对神经元活性及凋亡的影响：培养至7天左右的神经元,分别设3组：正常组、喜树碱组、喜树碱联合DRB(转录抑制剂)组。正常组神经元不做任何处理,喜树碱组加入41.8UM喜树碱(前期实验筛选出的IC50浓度),喜树碱联合DRB组加入41.8UM喜树碱和10UM DRB (常规用药浓度),干预24h后,CCK-8检测各组神经元活性变化,然后通过TUNEL染色法、γ-H2AX免疫荧光标记、流式细胞法,检测神经元DNA损伤及凋亡情况。结果：1.确定了喜树碱的用药浓度(ICso)和时间为：41.8UM喜树碱作用24h。2.明确了喜树碱抑制神经元活性的量效、时效关系：不同浓度喜树碱作用于神经元后,各组细胞活性的结果：12h时间点,与正常对照组比较,各用药组OD值均下降,2.5UM组细胞活性下降不明显,5UM组细胞活性显著降低(P<0.01),随着喜树碱浓度的增加,细胞活性下降更为显著。24h、48h时间点,与正常对照组比较,各用药组细胞OD值均显著下降(P<0.01,P<0.001),且随着浓度的增加,细胞活性下降愈显著。另一方面,同一浓度下,随着给药时间的延长,细胞活性下降越明显。3.喜树碱对神经元活性的影响：与正常对照组比较,喜树碱组OD值明显下降(P<0.001),提示喜树碱可显著抑制神经元的活性；与喜树碱组比较,喜树碱联合DRB组OD值升高(P<0.001),提示加入转录抑制剂DRB后,喜树碱对神经元活性的抑制作用明显下降。4.喜树碱对神经元γ-H2AX表达的影响：正常组神经元几乎看不到绿色荧光,提示正常组神经元7-H2AX阴性表达。喜树碱组神经元γ-H2AX的表达明显增多,绿色荧光颗粒主要分布在神经元的细胞核中,提示该组部分神经元出现了DNA损伤,加入转录抑制剂神经元组γ-H2AX的表达较喜树碱组神经元明显减少,提示加转录抑制剂作用后能减少神经元DNA损伤。5.三组神经元TUNEL染色结果：正常组神经元的细胞核较圆且规整,看不到荧光颗粒；喜树碱组神经元,细胞核形状变得不规则,胞核区标记有强弱不等的绿色荧光颗粒,且阳性着色的神经元比例明显增多,加转录抑制剂组神经元,细胞核形状不规则,阳性着色的绿色荧光颗粒较喜树碱组明显减少。6.流式细胞仪检测结果：与正常对照组比较,喜树碱组正常细胞百分比明显降低(2.9%),早期凋亡、晚期凋亡细胞百分比明显增多,分别达到40.1%、56.8%。与喜树碱组比较,加抑制剂组晚期凋亡百分比明显降低(15.3%),正常细胞百分比明显增多(12.0%)。结论：1.喜树碱对培养的原代小鼠皮层神经元活性具有较明显的抑制作用,且呈明显的浓度及时间依赖性。2.喜树碱可明显抑制神经元活性,引起神经元发生DNA损伤,乃至凋亡。结果证实了喜树碱具有神经元毒性作用。3.转录抑制剂DRB可有效减轻喜树碱诱导的神经元损伤和凋亡,提示喜树碱的神经元毒性机制可能与转录环节有关。