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第一部分RNAi阻低UBE3A后对乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学行为的影响目的:通过sh RNA及慢病毒载体阻低UBE3A的表达后,观察乳腺癌细胞株MDA-MB-231生物学行为的变化,以探讨UBE3A在乳腺癌细胞中的作用。方法:构建3条干扰UBE3A基因的表达载体UBE3A-sh RNA1、UBE3A-sh RNA2、UBE3A-sh RNA3和1条无关序列作为阴性对照Negative-sh RNA;在脂质体lipo2000介导下转化293T细胞,包装产生慢病毒载体,再将慢病毒载体转染至乳腺癌细胞株MDA-MB-231;荧光定量PCR检测UBE3A的干扰效率,筛选出干扰效率最高的干扰片段;Western blotting检测各组细胞UBE3A蛋白水平上的阻低情况;Transwell小室侵袭实验检测UBE3A阻低后,MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化;流式细胞术检测阻低UBE3A后,MDA-MB-231细胞周期情况;CCK-8试剂盒法检测阻低UBE3A后,MDA-MB-231细胞在24h、48h、72h增殖能力变化;对结果采用SPSS 22.0进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意。结果:成功构建及筛选出了干扰率最高的慢病毒载体LV-UBE3A-sh RNA;Q-PCR、Western blotting结果显示:相对空白组和阴性对照组,UBE3A阻低组UBE3A基因和蛋白表达均受到抑制,抑制率分别为89.5%、45.3%,差异具有统计学意义(P<0.05),空白组和阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05);CCK-8实验及Transwell小室侵袭实验结果显示:UBE3A阻低组与空白对照组及阴性对照组相比较,MDA-MB-231细胞增殖、侵袭能力均受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),空白组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞术结果显示:阻低UBE3A组与空白对照组及阴性对照组MDA-MB-231细胞各周期差异具有统计学意义(P<0.05),且阻低UBE3A组主要变化集中在S期,空白组与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:UBE3A阻低后,MDA-MB-231细胞的增殖能力、细胞周期以及细胞的侵袭能力等生物学行为发生明显变化,提示UBE3A在乳腺癌细胞中扮演着重要角色,其可能是乳腺癌治疗的一个潜在靶标。第二部分阻低UBE3A后对乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学行为影响的机制研究目的:通过2-DE为基础的差异蛋白质组学方法观察UBE3A阻低前后乳腺癌细胞株MDA-MB-231蛋白质的表达差异,探讨UBE3A对乳腺癌生物学行为影响的机制。方法:采用2-DE方法对UBE3A阻低前后MDA-MB-231细胞的总蛋白进行分离,PDQuest 7.1软件进行分析获得差异蛋白质,然后使用串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS/MS)对差异蛋白质进行鉴定;采用DAVID Functional Annotation及String在线工具分析差异表达蛋白质的细胞成分、生物学途径、分子功能及其之间的相互关系。结果:2-DE及串联质谱鉴定出阻低UBE3A前后28个差异蛋白质点,其中有4个蛋白质在阻低UBE3A组中相对高表达,24个相对低表达,除去鉴定相同的蛋白质后有24个差异蛋白质,与DAVID数据库有23个相匹配;DAVID Functional Annotation进行GO分类,能够进行生物学途径、细胞成分、分子功能注释分类的蛋白质分别为23(100%)、20(87.7%)和23(100%),而在泛素-蛋白酶体系统及糖代谢方面分类比较明确;String分析显示这些差异蛋白中有23个存在直接或间接的联系。结论:23个差异蛋白质之间存在着直接或间接的联系,特别在泛素-蛋白酶体系统功能及糖代谢功能方面发生变化,这可能是阻低UBE3A后乳腺癌细胞生物学行为改变的原因。