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乙烯作为一种植物激素,对植物种子萌发、生长发育、衰老、果实成熟、性别分化等有广泛的影响,同时与逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等方面有关;并参与植物细胞的程序性死亡。植物体内乙烯的生成量主要由ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)的活性大小决定,而这两个关键酶活性的提高是其mRNA表达的结果。利用基因工程克隆植物乙烯ACS和ACO基因,通过反馈调节、反义表达等调控乙烯合成,进而调控乙烯对植物的生理效应,是当前对乙烯研究的主要途径。国内有关实验已在番茄等一些跃变型果实中获得成功。研究乙烯合成酶基因和氧化酶基因的克隆、表达及调控机理,对全面了解乙烯对植物的生理效应及化控机理具有重要的指导意义。 本研究的目的:克隆番茄、黄瓜、花椰菜等3种蔬菜作物的ACC氧化酶基因,对其结构进行分析;克隆ACC氧化酶基因的启动子,研究ACO基因的表达规律,为从分子水平上调控该基因的表达打下基础。最后,构建正义、反义、RNAi植物表达载体,调控ACC氧化酶基因的表达。结果如下: 1.克隆了番茄ACO基因LeACO11基因组序列(gDNA)及相应的cDNA序列。测序结果分析表明:该基因gDNA序列长1697bp,由4个外显子、3个内含子组成。相应的cDNA序列长1018bp。生物信息学工具软件分析,预计该基因CDS全长951bp,编码316个氨基酸。RT-PCR结果与预测的CDS一致。gDNA序列与cDNA序列比对发现,内含子与外显子交替的位置总是以AG碱基出现,并被剪切。对该基因cDNA推断的蛋白质进行同源性分析,与番茄ACO3(CAA90904)的同源性为85%,ACO1(CAA41212)的同源性为82%。 2.利用载体介导的PCR方法克隆了LeACO基因的上游调控序列2000bp。测序结果分析表明,2000bp的片段含有起始密码子上游1946bp,+97～+99位为翻译起始密码子,(-29～-22)之间为TATA盒(TATAAATA),(-193～-189)为CAAT盒(CCAAT),-1724～-1300与-1037～-592高度重复,存在100多个转录因子结合位点。 3.对番茄植株不同组织及不同发育时期的器官(茎、叶片、花、果实的未成熟期、绿熟期、破色期、红熟期)ACO基因的表达分析发现,LeACO11基因在叶片中有微量表达,在未成熟期果实中没有表达,在绿熟期、破色期、红熟期果实中均有高水平的表达,且随成熟度的增加其表达量增强。推断该基因的表达具有时间和空间特异性。