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1．研究背景逆转录病毒家族共有7个属。它们与宿主的关系限制于哺乳动物内，能引起宿主一系列的疾病表现，包括肿瘤、神经系统疾病和免疫缺陷疾病，以及无症状的感染。逆转录病毒拥有一条单链RNA基因组。所有具有感染性的逆转录病毒颗粒拥有类似的结构。根据其种属不同，其基因组大小为7000nt到12000nt（HIV：9000nt，FV：8300nt）。Friend型鼠白血病病毒（FV）属于γ逆转录病毒属。当接种于易感成年小鼠后，它能诱导红细胞祖细胞多克隆增生，小鼠脾脏迅速增大，最终导致完全恶变的红白血病。目前研究HIV最好的模型是SIV模型。对于逆转录病毒的研究，FV模型所需动物和实验条件相比于SIV拥有显著优势。对FV的研究将加深和扩展我们对HIV／AIDS的认识。2．研究目的2．1测定FV基因组序列并分析其多态性；2．2复制FV动物模型，复制Real-Time RT-PCR法测定血清FV病毒载量；在此模型上探讨白藜芦醇抗FV感染的疗效和作用机制。3．研究方法3．1 Friend鼠白血病病毒全基因组测序及序列分析以感染FV 9天后小鼠脾脏为标本，提取总RNA。用随机引物将总RNA逆转录成cDNA。利用GenBank公布的序列设计6对特异性引物，以cDNA为模板重叠扩增FV基因组片断。PCR产物凝胶电泳分离纯化后，接入T载体，转化DH5α大肠杆菌细胞，涂板。PCR及酶切鉴定后每组挑一个阳性菌落测序。除却载体序列后的6段序列用ContigExpress拼接，从而获得连续的基因组序列。利用软件Clustalx1.83对比其与其他5条GenBank中的全基因组序列，分析SNPs信息、插入／缺失序列等。利用Phylip软件绘制进化树。3．2白藜芦醇抗FV实验研究3．2．1 FV病毒传代及滴度测定①FV病毒的传代：Balb／C小鼠5只，雌性。取实验室保存毒种流水冲浸融化，以DMEM培养液10倍稀释。每只小鼠腹腔注射0.5ml DMEM病毒稀释液。病毒接种13日后处死小鼠。取脾重大于1克者，以DMEM制成10％脾悬液，-70℃保存。②FV病毒滴度测定：将新制成的10％脾悬液倍比稀释成10-1 10-2 10-3 10-4 10-5共5个浓度，进行病毒滴度测定。以雌性Balb／C小鼠25只，随机分成6组，除一组5只外，其余五组每组4只。5只一组的小鼠作为正常对照组，其余5组每组用以上5个浓度的10％脾悬液腹腔注射，每只小鼠注射0.5ml。正常对照组注射等量生理盐水。接种后13天处死小鼠，称取鼠重、脾重，计算脾指数（脾指数=脾重／鼠重×100）。以脾指数大于正常组+3倍标准差者定位阳性，以REED-MUENCH法计算ID50。3．2．2白藜芦醇对FV致小鼠脾肿大的抑制作用研究雌性Balb／C小鼠61只，随机分为5组，分别为模型组12只，阳性药物AZT组12只，正常对照组12只，白藜芦醇高剂量组（100mg／kg／day）13只，白藜芦醇低剂量组（20mg／kg／day）12只。除正常对照组外，每只小鼠腹腔注射100ID50剂量的10％脾悬液。正常组腹腔注射0.5ml DMEM培养液。连续灌胃给药30天。接种后30天处死小鼠，称取脾重和鼠重，计算脾指数。进行t检验，以p＜0.05定为有统计学意义。3．2．3白藜芦醇对T淋巴细胞和B淋巴细胞的影响雌性Balb／C小鼠61只，随机分为5组，分别为模型组12只，阳性药物AZT组12只，正常对照组12只，白藜芦醇高剂量组（100mg／kg／day）13只，白藜芦醇低剂量组（20mg／kg／day）12只。除正常对照组外，每只小鼠腹腔注射100ID50剂量的10％脾悬液。正常组腹腔注射0.5ml DMEM培养液。连续灌胃给药30天。病毒接种30天后摘眼球取小鼠外周血EDTA抗凝，加入CD3抗体和CD19抗体并处理后上流式细胞仪测定CD3和CD19淋巴细胞的比率。进行t检验，以p＜0.05定为有统计学意义。3．2．4病毒RNA定量方法的复制以及白藜芦醇对FV病毒载量的影响Real-Time RT-PCR定量病毒载量方法的复制：用已测序鉴定了的FV病毒PCR片断为参考DNA。并根据此序列设计一对特异性引物和一个探针（Sense：5’-GGACAGAAACTACCGCCCTG-3’；Antisense：5’-ACAACCTCAGACAACGAAGTA AGA-3’；Probe：5’-FAM-TCGCCACCCAGCAGTTTCAGCAGC-TAMRA-3’），扩增片断长133nt。将参考DNA以10倍倍比稀释为8个梯度浓度，设其最小的浓度为101.3。建立20ul Real Time PCR反应体系如下：Master Mix 10ul；Sense（20umol／ml）0.2ul；Antisense（20umol／ml）0.2ul；Probe 0.8ul；模板DNA2ul；H2O 6.8ul：Total 20ul)在ABI 7300荧光定量PCR仪上进行反应。PCR反应程序为：95℃10秒；95℃10秒，60℃30秒，40循环。绘制标准曲线，以此来定量待测样品的cDNA浓度。雌性Balb／C小鼠61只，随机分为5组，分别为模型组12只，阳性药物AZT组12只，正常对照组12只，白藜芦醇高剂量组（100mg／kg／day）13只，白藜芦醇低剂量组（20mg／kg／day）12只。除正常对照组外，每只小鼠腹腔注射100ID50剂量的10％脾悬液。正常组腹腔注射0.5ml DMEM培养液。连续灌胃给药30天。病毒接种30天后摘眼球取小鼠外周血，离心取100ul血清。用试剂盒提取血清中总RNA，逆转录成cDNA。以测序鉴定了的FV病毒PCR产物为参考DNA，用Real Time RT-PCR法定量cDNA的含量。结果用t检验，以p＜0.05为具有统计学意义。4．研究结果4．1①测序获得7610nt基因组序列信息，缺乏部分非编码区信息(5’约500nt，3’端约150nt。②与GenBank中的5条已知序列比较后发现341处SNPs。其中gag基因含有65nt SNPs，其变异频率为4.0％；pol基因含有161nt SNPs，其变异频率为4.5％；env基因含有97nt SNPs，其变异频率为4.78％。③341处SNPs只有一处出现了三等位基因，其余皆为二等位基因。④80.6％的SNPs表现为碱基转换（A→G和T→C）⑤在nt7480-7490之间发现各基因组出现显著的插入／缺失变异，多达84nt。⑥nt4849的突变导致pol基因终止密码子由nt5320-5322提前至nt4849-4851。这个突变导致pol编码蛋白减少157个氨基酸。4．2．1 FV病毒的ID50为10-3.5 10％脾悬液0.5ml。如果以100倍ID50剂量的病毒攻击小鼠，则需将10％脾悬液稀释31.6倍，取0.5ml作腹腔注射。4．2．2模型组小鼠因脾脏肿大死亡2只（2／12）。白藜芦醇组小鼠实验期间全部存活。白藜芦醇对病毒导致的脾肿大具有抑制效果，其100mg／kg／day剂量的脾指数抑制率为32％。4．2．3 FV感染小鼠模型组的T、B淋巴细胞显著降低，抗逆转录病毒药物AZT能明显提高T、B淋巴细胞百分比。白藜芦醇的干预能够显著改善其T淋巴细胞（P＜0.05），但对B淋巴细胞比例未能有明显影响。4．2．4 AZT明显降低了血清病毒载量，降低了86.6％（P＜0.01）。白藜芦醇100mg／kg／day剂量组降低血清病毒载量68.7％（P＜0.05）。5．结论5．1 FV作为逆转录病毒其基因变异频率远高于其他RNA病毒和DNA病毒。SNP主要表现为以碱基转换为主（A→G和T→C），且多数为二等位基因。5．2白藜芦醇对FV感染小鼠有保护作用，能够抑制病毒导致的脾肿大，能提高感染小鼠的T淋巴细胞，降低血清病毒载量。白藜芦醇具有抗FV的作用。