论文部分内容阅读
番茄是一种起源于热带的喜温蔬菜作物,但其对高温的抗性并不强,而高温通常伴随着干旱,这两种胁迫严重时会使番茄结实率低下,造成减产。因此,研究番茄的高温、干旱抗性具有重要的科学意义和应用价值。另外,番茄在环境变化时,又极易染病,严重时,造成番茄果实大面积腐烂,减产。同样,对番茄抗病性的研究也具有现实意义。当植物遭受逆境胁迫时,细胞内蛋白质内稳态遭到破坏,产生大量活性氧(ROS),光合作用受到抑制。Dna J蛋白作为一种广泛的胁迫响应因子,它具有独自或协助Hsp70完成蛋白质折叠、解折叠、聚合和调节蛋白复合物解聚等功能,在逆境胁迫下蛋白质或蛋白复合体稳定性的维持方面发挥重要作用。因此,研究逆境胁迫下番茄Dna J蛋白的功能,具有非常重要的理论和现实意义。本研究克隆了一个番茄叶绿体定位的Dna J蛋白基因(SlCDJ2),并以转正、反义SlCDJ2的番茄和过表达SlCDJ2的烟草为材料,探讨了转SlCDJ2基因番茄在高温胁迫下维持Rubisco活性和转SlCDJ2基因烟草在干旱和病原菌胁迫下ROS清除能力等方面的功能,主要结果如下:(1)从番茄叶片中分离得到SlCDJ2(Gen Bank序列号:AK323942.1),该基因全长为1159bp,开放阅读框为834bp,编码277个氨基酸。预测分子量为32.7k Da,等电点为9.30。该基因位于番茄12号染色体上。(2)RT-qPCR分析发现,SlCDJ2在番茄的根、茎、叶、花和果中均有表达,其中在叶片中的表达量最高,同时,高温、干旱、SA和病原菌均可诱导SlCDJ2表达。经过western blot进一步分析发现,SlCDJ2明显受到42°C的诱导表达。(3)构建SlCDJ2-GFP融合蛋白,并瞬时转化拟南芥原生质体,通过Confocal观察发现SlCDJ2蛋白定位于叶绿体。Western blot结果进一步显示SlCDJ2蛋白均匀地分布在叶绿体基质和类囊体膜上。(4)构建了pET-SlCDJ2原核表达载体,成功诱导SlCDJ2在大肠杆菌BL21中表达,并将诱导表达的蛋白质纯化后免疫小鼠,制备抗体,测得效价为1:10000,用于接下来的western blot实验。(5)酵母双杂交实验结果表明SlCDJ2可以与番茄叶绿体定位的cp Hsp70互作。(6)将SlCDJ2的编码区连入p BI121载体,构建了SlCDJ2的过表达和抑制表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,获得正、反义转基因番茄植株,同时,将过表达载体转入烟草中,获得过表达SlCDJ2烟草植株。并通过PCR、q RT-PCR以及western杂交的方法检测具有卡那抗性的转基因植株,结果表明成功获得了SlCDJ2过表达和抑制表达的转基因番茄植株和转基因烟草植株。(7)高温胁迫下,过表达SlCDJ2番茄具有较高的CO2同化速率、Rubisco活性和Rubisco大亚基含量。RT-q PCR分析发现高温处理后,衰老诱导表达的几个基因(SENU3、Sl SGR1、LX、Rbc L、Rbc S、Psb A)在转基因和WT番茄中均发生了相应的上调和下调表达。此外,蛋白水解酶活性检测发现高温处理后,反义植株水解酶活性明显高于WT和正义植株,说明SlCDJ2可能通过维持较低的蛋白水解酶活性来缓解Rubisco的降解速度,进而缓解光合作用所受的抑制。(8)在干旱胁迫下,过表达SlCDJ2能减少转基因烟草H2O2和O2·-的积累。与Vec植株相比,转基因植株具有相对较高的最大光化学效率、净光合速率和D1蛋白含量。因此,过表达SlCDJ2能够增强转基因烟草对干旱的抗性。(9)用青枯假单胞菌侵染转基因烟草和Vec植株后,病原菌对转基因植株的伤害程度明显小于Vec植株。无论过氧化氢染色还是台盼蓝染色,均说明转基因烟草对病原菌的抗性强于Vec植株。通过对抗病基因的RT-q PCR检测发现,PR1a和PR2基因在转基因植株中表达量明显高于Vec植株,这说明SlCDJ2参与了抗病响应,且过表达SlCDJ2增强了转基因烟草的病原菌抗性。