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叶酸作为一碳基团(one carbon group)的供体和受体,是植物体内参与C1转移反应的重要辅酶。DFC(DHFS-FPGS Homolog C)基因编码线粒体定位的叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS),负责将谷氨酸残基通过γ-肽键逐个加在叶酸衍生物上以形成多谷氨酸尾形式的叶酸。本实验室获得一个拟南芥DFC基因的T-DNA插入突变体dfc,前期分析表明该突变体的T-DNA插入在基因的第15个外显子中,dfc突变体与拟南芥哥伦比亚野生型在正常生长条件下没有明显的表型差异,而在含有0.3 mM NO3-的低氮环境下却有明显表型,例如,幼苗主根长度只有野生型的50%左右,叶片有花青素的积累等。同时,突变体内总叶酸含量及主要组分5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸的含量均明显低于野生型植株。在此基础上,本文利用DFC过表达转基因植株分析了该基因对叶酸组分和植物适应低氮胁迫的影响,同时发现高浓度C02条件下dfc突变体的低氮胁迫表型可以得到恢复,由此探讨了拟南芥叶酸代谢、光呼吸代谢和氮代谢的相互关系。主要研究结果如下:1.将CaMV 35S启动子驱动的DFCcDNA过表达载体转化哥伦比亚野生型拟南芥,经抗性筛选和PCR鉴定共获得15株T1代转基因植株,进一步筛选获得7个转基因纯合株系;2.对7个DFC转基因纯合株系进行半定量RT-PCR转录水平表达量分析和Western blot蛋白表达量分析,发现7个株系的转录水平表达量均不同程度地高于野生型,其中DFC OE5表达最强,而转基因植株中只有5个株系的蛋白表达量高于野生型,其中DFCOE5中DFC蛋白含量最高;3.运用HPLC/MS/MS法对7个过表达DFC转基因纯合株系进行叶酸含量的分析,发现7个株系的总叶酸含量、5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)和5-甲酰四氢叶酸(5-CHO-THF)含量均高于野生型植株,其中,多个株系的叶酸含量与野生型具有显著性差异或极显著性差异,但过表达植株对低氮胁迫的耐受能力与野生型植株相比并没有明显提高;4.dfc突变体在高浓度CO2的非光呼吸条件下,低氮胁迫表型有所恢复,主根长度恢复到野生型附近,叶片不再呈现紫色;5.对dfc突变体在空气中和高浓度CO2的非光呼吸条件下的氨基酸含量进行测定和分析,发现空气中突变体内的甘氨酸(Gly)大量积累,而在高浓度CO2条件下,Gly的含量有所下降;6.对dfc突变体在空气中和高浓度CO2的非光呼吸条件下的叶酸含量进行测定和分析,发现空气中突变体较低的叶酸含量在高浓度Co2条件下基本恢复到与野生型相当的水平。以上结果表明,1)DFC基因在拟南芥叶酸合成代谢途径中发挥着重要作用,直接影响到叶酸合成代谢的完整性和叶酸组分含量的变化,但DFC基因的过量表达可能并不足以提高拟南芥的低氮耐受能力;2)DFC基因的突变使低氮胁迫下幼苗的氮循环和Gly/Ser转化效率有所下降,高浓度CO2条件通过削弱拟南芥的光呼吸强度,使得dfc突变体的低氮胁迫表型、Gly/Ser比值和叶酸含量都恢复到与野生型相似的水平,表明DFC基因可能通过影响光呼吸而参与拟南芥的低氮胁迫反应。