茭白孕茭及共生黑粉菌体外培养和快速检测技术的研究

来源 :杭州师范大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:Daniel999
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
茭白(Zizania caduciflora L.)为原产于中国及东南亚的多年水生宿根性草本植物,是我国重要的水生蔬菜之一。茭白的肉质茎,是由在其植株内共生的茭白黑粉菌(Ustilago esculenta P. Henn)在适宜的条件产生的代谢产物作用于植株细胞形成的。随着种植茭白后带来的经济效益越来越丰厚,我国茭白种植面积也正每年大幅度提高,从而也带动了科学工作者对茭白及其共生黑粉菌研究的热情。在以往的研究中,茭白黑粉菌的体外快速培养,以获得大量供实验用菌种一直是研究中的一个难点,本文将以茭白黑粉菌体外培养为中心,展开相关的研究。本文以我国主栽的32个茭白品种为研究基础,运用随机扩增的多态性DNA (RAPD)技术,初步鉴定它们的亲缘关系。而后使用DNA分子标记技术对分离得到的茭白黑粉菌进行快速鉴定,并以摇瓶发酵法为基础,研究了一套茭白黑粉菌体外快速培养的方法,同时对发酵条件下菌丝体的主要代谢激素进行了连续测定,观察其变化规律。研究结果表明:采用RAPD技术,以32种茭白的混合基因组DNA为模板,通过对70条随机引物的筛选,挑选出12条多态性高且扩增条带较明显的引物用于不同品种茭白DNA的PCR扩增,共产生了75条DNA片段,平均每个引物扩增出6.2条。其中21条扩增带具有遗传多样性,约占总DNA数的28%。将扩增条带转化成二维数据后进行聚类分析,结果表明,在遗传距离0.19处可以将32个茭白品种分为7个聚类群,其中第一聚类群所包含21个茭白品种,占本次检测品种的65.63%,初步研究表明,我国目前主栽的茭白品种间的遗传相似性比较接近。利用dot-ELISA技术建立了一套茭白黑粉菌DNA的快速检测新方法。使用生物素(Biotin)标记的上游引物和未标记的下游引物对茭白黑粉菌的一段DNA进行PCR扩增,使扩增产物带上生物素标记。将带有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate, FITC)标记的探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体,该杂交体通过FITC抗体(Anti-FITC)被固定在硝酸纤维素膜(Nitrocellulose, NC)表面。然后用碱性磷酸酶标记的亲和素(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin, AP-SA)与杂交体上的生物素结合,漂洗后加底物显色。该方法特异、灵敏、快速,可以检测出约0.2pg/ml的基因组DNA,对从不同品种茭白中提取出的茭白黑粉菌以及对照菌种进行检测,结果与预期完全一致。通过对摇瓶发酵培养方法的优化,快速获得大量可供实验用茭白黑粉菌菌丝体。经过对种子液生长曲线的研究,对培养液、初始pH值、发酵温度、摇床速度、接种量以及发酵时间的优化,摸索出一套较完整的茭白黑粉菌摇瓶液体发酵的方法。试验确定的摇瓶液体发酵的最佳条件是:综合PDA培养液、初始pH值为6、发酵温度28℃,摇床速度130r/min、接种量5%、发酵6d时间后达到稳定生长期。利用酶联免疫法(ELISA),对茭白黑粉菌在摇瓶发酵培养的条件下,发酵培养液及对应菌丝体中的赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素(Z)及玉米素核苷(ZR)等五种主要内源激素含量在液体培养时的动态变化进行测定,发现了这些激素随着发酵时间变化的动态规律。
其他文献
目的:研究格尔德霉素(Geldanamycin,GA)对β淀粉样肽(β-amyloid peptjde,Aβ)生成的影响,初步探讨GA降低Aβ的作用机制。方法:利用哺乳动物细胞表达载体pCMV5,构建β淀粉样肽前体
我国是重要的产棉大国和纺织品出口国,棉花在我国国民经济中占有十分重要的地位,提高棉花的产量和品质对我国民生意义重大,同时也是棉花育种的主要目标。传统育种方法难以达到产量和品质的同步提高。利用基因工程方法可以打破物种间的遗传障碍,实现优良目的基因的定向转移,且后代易于稳定,育种周期短,为进一步改善棉花的产量和品质提供了一条有效的途径。利用基因工程改良棉花的产量和品质,首先必须清楚棉花生殖发育过程的分
嗜肺军团菌是军团病的病原茵,该细菌污染中央空调水系统并通过喷雾作用形成气溶胶后,人吸入就会患病。嗜肺军团菌可在贫营养的空调冷却水中存活一年以上,在稳定期对氧化剂、酸性
本实验室先前在大蹄蝠(Hipposideros anniger)的听觉中脑—下丘(inferiorcolliculus,IC)的研究显示,神经元对恒频-调频(constant frequency-frequencymodulation,CF-FM)声刺激
本文对比了两种引物T7和159对藻核酸和噬藻体PP的核酸的扩增效率,发现引物159可以特异性扩增出噬藻体PP的核酸,通过克隆测序,优化设计了引物159B,该引物可以高效地扩增出噬藻体PP
铜是应用于许多经济作物的杀真菌剂里一种重要的组成成分。但是,现在人们对铜杀菌剂产生一种关注是由于其对于有益生物潜在的副效应。本次实验的目的就是探索铜对黑腹果蝇(Dros
西南喀斯特地区与黄土高原同为我国贫困和环境退化问题最为突出的地区。在生态环境脆弱的喀斯特地区,环境移民是缓减人口压力和实现生态恢复的有效途径。为探讨大规模的移民对