论文部分内容阅读
吲哚-3-乙酸(IAA)作为一种天然存在的植物生长素,能对植物的发育起到重要促进作用。与植物生长发育或病害过程有关联的微生物中,许多也具有产生IAA的能力,从而使这些微生物影响和改变植物的生理过程。阐明植物生长促进细菌(PGPB)的IAA合成情况以及IAA合成机制有助于理解这类微生物的促生机制。吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007可以促进杨树等林木的生长,是一株良好的PGPB。已知其能够合成植物激素IAA是其发挥促生作用的原因之一。本研究将进一步分析外部环境条件对B.pyrrocinia JK-SH007分泌IAA的影响,并对其IAA的合成途径进行功能分析。主要研究结果如下:(1)B.pyrrocinia JK-SH007分泌IAA的能力通过Salkowski比色法、酶联免疫吸附法(ELISA)及高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)三种方法进行鉴定,表明B.pyrrocinia JK-SH007可以合成IAA,且能合成IAA合成通路相关中间体吲哚-3-丙酮酸(IPyA)、吲哚-3-乙腈(IAN)、吲哚-3-乙酰胺(IAM)以及色胺(TAM);研究了B.pyrrocinia JK-SH007菌株生长与合成IAA的关系,表明菌株生长稳定期的IAA合成量最高;研究了L-色氨酸(L-Trp)、温度和pH对B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA的影响,表明L-Trp对菌株分泌IAA具有显著促进作用,B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA的最佳温度是37℃,最适pH为7。(2)通过B.pyrrocinia JK-SH007无细胞提取物的IAA生成试验和利用B.pyrrocinia JK-SH007全基因组和NCBI及KEGG数据库的比对注释分析,表明B.pyrrocinia JK-SH007中含有IAM途径和TAM途径所需的全部基因,说明B.pyrrocinia JK-SH007极有可能通过完整的IAM途径和TAM途径合成IAA。(3)运用PCR技术对B.pyrrocinia JK-SH007中IAM途径关键基因——编码色氨酸2-单加氧酶基因iaaM及编码吲哚乙酰胺水解酶基因iaaH进行克隆,并通过生物信息学分析,表明:基因iaaM全长1 782 bp,可以编码593个氨基酸,蛋白分子量为64.81 kD,不具有信号肽;基因iaaH全长1 368 bp,能够编码455个氨基酸,蛋白分子量为47.28 kD,不具有信号肽。通过二级结构和系统发育分析说明两者在进化上均具有一定保守性;iaaM和iaaH基因在L-Trp处理下差异表达的实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)分析显示,两者表达量均显著提高,表明IAM途径在B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA的过程中发挥了一定作用。(4)通过原核蛋白表达和底物喂养试验验证IAM途径的两个关键酶——色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺水解酶的活性,表明两者均具有活性,IAM途径在B.pyrrocinia JK-SH007中具有活性且具有一定作用。本研究表明B.pyrrocinia JK-SH007具有合成IAA及其中间体的能力,L-Trp对菌株合成IAA具有显著促进作用,温度37℃、pH为7是B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA的最佳条件;B.pyrrocinia JK-SH007的全基因组分析表明其可能具有完整的IAM和TAM合成途径,并分别从分子及蛋白水平对B.pyrrocinia JK-SH007基于IAM的IAA合成途径进行了功能验证,揭示了IAM途径在B.pyrrocinia JK-SH007 IAA合成中的分子功能机制,为探究B.pyrrocinia JK-SH007的促生机制奠定了基础。