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细胞色素P450羟化酶基因(Cytochrome P450 hydroxylase,NtCYP71D16)催化烟草西柏三烯一醇脱氢生成西柏三烯二醇,是烟草西柏烷类腺毛分泌物生物合成的关键酶基因,对烟草叶面化学的形成具有重要影响。本文克隆了烟草栽培品种K326的NtCYP71D16基因,采用RT-PCR技术和Promotor-GUS infusion技术,分析了该基因的组织表达特性以及对温度和MeJA的应答反应模式;比较了典型烤烟品种中叶面腺毛的形态、西柏烷类化合物积累以及西柏烷代谢途径关键酶基因(NtCYP71D16和NtCYC)表达的差异;在此基础上,采用RNAi技术,实现了NtCYP71D16基因在K326中的抑制表达,并对RNAi转基因植株的农艺性状、叶面化学成分、抗性及烤后烟叶香气成分进行了比较分析。该研究结果为NtCYP71D16基因在烟草叶面化学调控及抗性及品质改良中的应用奠定了理论基础。主要研究结果如下:1、采用同源克隆技术,在烤烟K326中获得三条NtCYP71D16(AF166332.1)基因同源序列NtCYP71D16,NtCYP71D16v2,NtCYP71D16v3。NtCYP71D16蛋白与普通烟草Ti1068(AF166332.1)基因同源性达100%,与NtCYP71D16v2以及NtCYP71D16v3的同源性为93.9%,而NtCYP71D16v2与NtCYP71D16v3的同源性为96.1%。蛋白质结构域分析发现3个蛋白均包含P450蛋白家族保守的结构域,表明该基因属于P450家族。2、采用RT-PCR技术对K326根、茎、叶、腺毛、去腺毛的叶片、花等不同组织中的NtCYP71D16基因表达进行了比较分析。结果发现,NtCYP71D16基因在花中表达量占绝对优势,在叶面腺毛中表达量较高,去腺毛叶片中表达量明显降低,在种子、茎和根中表达水平较低。采用Promotor-GUS infusion技术对NtCYP71D16基因启动子活性进行了分析,CYP-GUS转基因植株GUS组织化学染色表明,NtCYP71D16基因除在根部表达外,主要在茎、叶、花的腺毛中特异表达。对CYP-GUS转基因植株分别进行4℃、28℃和42℃的温度处理,GUS酶活检测表明高温和低温对NtCYP71D16基因的表达均有诱导作用。(4)CYP-GUS转基因植株喷洒0.8%的MeJA溶液后,GUS染色后腺毛头部未见明显蓝色,说明MeJA对NtCYP71D16基因表达有抑制作用。3、利用超景深显微技术、RT-PCR技术以及GC/MS技术,分析了烟草不同烤烟品种(中烟100、K326、红花大金元、翠碧1号、豫烟11)腺毛形态、叶面分泌物以及NtCYC、NtCYP71D16基因的表达特性。结果表明:(1)烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。(2)西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。(3)西柏烷类合成酶关键基因NtCYC和NtCYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因NtCPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。4、采用RNAi技术,构建Nt CYP71D16基因的抑制表达载体pK7GWIWG2(II)-CYP71D16,通过农杆菌转化介导法转化K326,在Kan浓度为30mg/L的MS筛选培养基上得到阳性植株,分子检测证明NtCYP71D16基因表达受到明显抑制。叶面化学检测表明两个株系的西柏三烯一醇的含量均高于K326,西柏三烯二醇的含量均低于K326;对转基因植株进行蚜虫处理发现,CYP-RNAi转基因植株有明显抗蚜虫的效果;对转基因植株进行香气分析发现,西柏烷类的降解产物茄酮的含量明显低于对照K326。