肝移植是治疗终末期肝病的有效手段,供体肝脏的质量是决定肝移植预后的关键因素。然而,随着等待肝移植患者数量的逐年增加,供体肝脏的相对缺乏促使心脏死亡供体(Donation after cardiac death,DCD)肝脏等扩大标准供肝应用于临床[1]。相较脑死亡供体(Donation after brain death,DBD)肝脏而言,由于DCD肝脏在获取前已经存在热缺血损伤,因此这类肝脏的缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)更严重,容易导致移植术后器官原发性无功能(Primary non-function,PNF)、移植术后胆道缺血和急慢性排斥反应等并发症[1,2]。因此,如何减轻DCD肝脏IRI,优化DCD肝脏质量和改善肝移植患者预后,成为肝移植领域亟需解决的热点问题。静态冷保存(Cold storage,CS)目前仍是供体器官保存的最主要手段。但在低温保存期间(0-4℃),由于有氧呼吸尚未完全停止导致营养物质的耗尽和代谢废物的产生[3],因此CS并不能对DCD肝脏进行有效的维护和修复。相比之下,低温机械灌注(Hypothermic machine perfusion,HMP)作为一种新型的动态器官保存方法,它在低温状态下经门静脉持续低流量地对肝脏进行氧合灌注,能够持续为肝脏提供代谢所需物质和能量并清除累积的毒性代谢产物[4]。动物实验研究和临床试验均表明,HMP较CS能够显著改善DCD肝脏质量,并能缩短术后恢复时间,降低移植术后肝脏PNF和胆道缺血等严重术后并发症的发生率[5,6]。然而,HMP改善DCD肝脏质量的具体分子生物学机制尚不明确。既往研究证实,TXNIP/NLRP3炎性体通路在缺血再灌注损伤中发挥了重要作用,当细胞处于氧化应激状态时,TXNIP会被激活并与NLRP3相结合从而激活下游炎性体通路,导致炎性因子的释放和细胞焦亡。HMP可以显著改善DCD肝脏的氧化应激状况,因此我们推测HMP可能存在抑制TXNIP/NLRP3炎性体通路进而减轻DCD供肝缺血再灌注损伤的机制。因此本课题在建立起大鼠DCD模型,肝脏HMP系统和常温离体复灌系统的基础上,研究TXNIP/NLRP3炎性体通路是否参与了HMP改善DCD肝脏质量的作用机制。研究结果揭示了HMP改善DCD肝脏质量的分子机制,为拓展供体池提供有效的方法和有力的理论依据。第一部分低温机械灌注对于大鼠心脏死亡供肝的保护效果研究目的:为了研究HMP对于DCD肝脏的保护机制,我们需首先建立起稳定的HMP系统并证实其对DCD肝脏的保护效果。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注以模拟肝移植手术,然后评估肝脏的损伤。结果:与CS组相比,HMP可明显减轻肝脏损伤并改善肝功能。肝酶释放,肝内阻力指数,组织学表现,细胞凋亡率,氧化应激和炎症反应的结果均可证实。通过对HMP期间肝脏氧耗率的检测证实非主动氧合的低温机械灌注也能为肝脏提供充足的氧气。我们的研究结果还表明,DCD肝脏低温保存结束后(无论是CS还是HMP)损伤并不显著,常温再灌注显著激活CS组的肝脏损伤,HMP组肝脏由于再灌注前获得修复,再灌注损伤并不显著。结论:相比于传统的静态冷保存,低温机械灌注在保护DCD肝脏质量方面具有独特的优势。低温机械灌注为保存期间的肝脏提供充足的氧气并重新补充能量,减少肝窦淤血和DAMPs的释放,从而减轻肝脏在再灌注阶段受到的损伤。然而,低温机械灌注减轻DCD供肝缺血再灌注损伤的具体分子生物学机制仍不清楚,这需要我们进一步探索。第二部分TXNIP/NLRP3炎性体通路在低温机械灌注改善大鼠心脏死亡供肝质量的机制研究目的:在已经证实HMP对大鼠心脏死亡肝脏质量有明确的改善效果之后,我们探究TXNIP/NLRP3炎性体通路是否在HMP改善DCD质量的机制中发挥重要作用。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注。在离体再灌注前后获取三组肝脏标本,然后进行免疫蛋白印记(Western blotting)和免疫共沉淀(Coimmunoprecipitation)以确定TXNIP/NLRP3炎性体通路的激活情况。结果:与对照组相比,免疫蛋白印记结果显示再灌注后CS组TXNIP/NLRP3炎性体通路的蛋白表达显著上升,免疫共沉淀显示再灌注后CS组TXNIP/NLRP3复合物形成也显著增多。与CS组相比,再灌注后HMP组TXNIP/NLRP3炎性体通路的蛋白表达和TXNIP/NLRP3复合物形成均被显著抑制。结论:低温机械灌注可以在肝脏保存期间对其进行修复减轻DCD肝脏的再灌注损伤损伤,其机制与TXNIP/NLRP3炎性体通路相关。再灌注导致的氧化应激促进TXNIP与NLRP3结合,激活下游炎性体通路。HMP通过抑制氧化应激,进而抑制了TXNIP/NLRP3炎性体通路,从而达到减轻供肝再灌注损伤和优化供肝质量的目的。第三部分TXNIP/NLRP3炎性体通路在DCD肝脏中的表达模式研究目的:探讨TXNIP/NLRP3炎性体通路在肝脏中的表达模式,明确HMP调控TXNIP/NLRP3炎性体通路的具体机制。方法:将18只SD大鼠随机分为对照组,CS组和HMP组。建立大鼠DCD模型,大鼠肝脏在心脏骤停后历经30分钟的热缺血。然后对肝脏行CS或HMP保存3小时。对照组肝脏不作处理直接获取。三组肝脏行1小时的常温离体再灌注。获取三组肝脏标本,然后进行免疫荧光标记(Immunofluorescence)以确定TXNIP和NLRP3在肝脏细胞中的分布情况。结果:免疫荧光双标记显示:TXNIP和NLRP3均主要在肝细胞中表达,在内皮细胞中表达较少。免疫荧光单标记结果显示:与对照组相比,CS组TXNIP核转位现象显著,且胞质内NLRP3表达也显著上升;与CS组相比,HMP组TXNIP核转位现象和胞质内NLRP3表达上升被显著抑制。结论:TXNIP/NLRP3炎性体通路主要在肝细胞中发挥作用。HMP调控TXNIP/NLRP3炎性体通路具体机制如下:HMP抑制再灌注导致的氧化应激,进而抑制TXNIP的核转位现象和NLRP3的胞质内表达上升。随后,HMP抑制TXNIP和NLRP3在细胞质内结合导致下游的炎性体通路的抑制。由于TXNIP和NLRP3在内皮细胞中表达较少,我们认为HMP通过提供流体剪切力刺激进而抑制肝脏中TXNIP的表达并不是HMP抑制TXNIP/NLRP3炎性体通路的主要机制。