鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3(EtRON2和EtRON3)的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数(ACI)以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数(ACI)以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子(TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10)水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显著,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3(EtRON2和EtRON3)进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显著的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显著的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。