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浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)脂肪酸合成途径中,硫酯酶可催化脂酰-ACP(酰基载体蛋白)水解生成脂肪酸和ACP,缓解脂酰-ACP对脂肪酸生物合成调节机制的反馈抑制作用,同时释放的脂肪酸是胞内甘油三酯、磷脂和甾醇等生物合成的重要原料,并且硫酯酶具有自身的底物偏好性,参与调控菌体的脂肪酸组成。因此,高产脂R.opacus PD630的硫酯酶可能是该菌脂质代谢调控的又一个关键酶,对该酶进行研究为改造此菌生成生物柴油带来可行途径。目前为止对参与调控R.opacus PD630脂肪酸合成的硫酯酶基因的研究尚未见报道,因此本文以大肠杆菌和R.opacus PD630为研究对象,分别将R.opacus PD630的四个内源硫酯酶基因在这两株菌中进行过表达,通过测定重组菌株的总脂肪酸产量和脂肪酸组成,并分析四个酶的蛋白质表达情况,来探究这四个硫酯酶对脂肪酸合成的影响。具体研究内容如下:首先在大肠杆菌BL21中,分别过表达硫酯酶TE1、TE2、TE3和TE4,获得四种重组菌株BLTE1、BLTE2、BLTE3和BLTE4。在同等条件下对各重组菌进行诱导培养24 h后,各菌中可溶性目的蛋白质的表达量较高,分析脂质含量发现:与对照菌株BL1相比,菌株BLTE2和BLTE4总脂肪酸产量分别增加了34.6%和21.3%,而菌株BLTE1和BLTE3的总脂肪酸产量与对照菌株差别不大。但是,脂肪酸组成分析发现:与对照菌株相比,重组菌中不饱和脂肪酸C16:1和C18:1的含量均显著提高,其中C16:1增加了1-2倍,C18:1增加了5-7倍;而饱和脂肪酸C14:0、C16:0、C17:0和C18:0的含量均明显降低,其中C14:0减少了45-60%,C16:0减少了20-50%,C17:0减少了80%以上,而C18:0则未能检测出来。因此,我们推测R.opacus PD630的四个硫酯酶在大肠杆菌细胞中均具有一定生物活性,且它们的作用底物偏好于C16:1和C18:1脂酰-ACPs。随后我们在R.opacus PD630中分别过表达这四个内源硫酯酶,构建了重组菌株PDTE1、PDTE2、PDTE3和PDTE4。分析蛋白质的表达情况发现,目的蛋白质表达以可溶性为主,但表达总量很低。在相同的条件下对各重组菌进行诱导培养,并于不同时间点进行取样,分析其生长状况、总脂肪酸产量和组成。对照菌株PDPJAM2,在18 h后进入对数生长期,60 h之后进入稳定期;而重组菌株的生长相对缓慢,在24 h之后进入对数生长期,72 h之后进入稳定期。菌株PDTE2和PDTE4进入稳定期后总脂肪酸产量(脂肪酸占细胞干重的比例,w/w)可达44-45%,相比对照菌株PDPJAM2提高了28%;而菌株PDTE1和PDTE3与对照组差别不大。同时,分析菌株脂肪酸组成发现,菌株PDTE2和PDTE4进入稳定期后C16:0脂肪酸均降低了24%,C17:0脂肪酸分别降低了65%和55%;而菌株PDTE2的C16:1、C17:1及C18:1脂肪酸均增加了35%,菌株PDTE4的C17:1及C18:1脂肪酸则分别增加了55%和34%。但重组菌株PDTE1和PDTE3的脂肪酸组成与对照组相比没有明显变化。上述结果表明,硫酯酶TE2和TE4与R.opacus PD630细胞的脂肪酸合成相关,能提高总脂肪酸产量并改变脂肪酸组成;而TE1和TE3在R.opacus PD630细胞中活性很低,对其脂肪酸合成几乎没有影响。此结果也为进一步为通过生物技术改造R.opacusPD630脂质代谢途径来生成生物柴油提供可能性。