冠心病(coronary heart disease, CHD)严重威胁人类的健康和生命,具有较高的致残率和致死率。动脉粥样硬化((Atherosclerosis, AS)是冠心病和其他心脑血管疾病的病理病变基础。但是,其发病机制目前尚不明确,对于AS发病机制的研究一直是心脏医学的难点和热点。近年来认为AS是一种慢性炎症和自身免疫性疾病,炎症和免疫是致AS发病的中介和中心环节,其理论核心是：由于各种致动脉粥样硬化危险因素等抗原的刺激使T淋巴细胞激活,T淋巴细胞激活引起特异性细胞免疫及体液免疫反应,同时巨噬细胞、血小板和平滑肌细胞等效应细胞激活,局部炎性因子分泌明显增加,导致AS的发生发展和斑块的破裂。随着研究的深入,越来越多的证据显示炎症和免疫贯穿了AS发生、发展的整个过程。树突状细胞在各种炎症免疫反应中(dendritic cells, DCs)起到了重要的作用。DCs起源于骨髓中CD34+多能干细胞,其发育经历前体细胞、未成熟细胞、成熟细胞三个阶段。作为体内的抗原呈递细胞(antigen presentation cell,APC),DCs的抗原呈递作用最为强大。DCs负责捕获、处理、呈递抗原给T淋巴细胞从而启动初次和二次免疫应答,是机体免疫反应的始动者。与单核巨噬细胞或B淋巴细胞等APC相比较,DCs激活T淋巴细胞的作用是他们的数十至数百倍,因此在免疫应答的诱导和调节中发挥着关键作用。近年来,研究发现在正常动脉壁中也存在有DCs,当血管存在AS病变时,DCs数量明显增多,因此DCs可能与AS的发病明显相关。与一般动脉壁相比,DCs在血管容易形成AS病变的血管壁显著增多,并且常成簇聚集。DCs在血液涡流压力较大的血管处集聚,周围常常伴随有激活的T淋巴细胞和巨噬细胞,提示AS的早期发病可能与DCs介导的免疫机制有关。DCs在AS病变区尤其在脂纹和纤维斑块中大量的聚集,与正常动脉壁比较其数量显著增多。在粥样硬化斑块中,DCs主要集中在斑块容易破裂的部位,并且斑块中并存着丰富的T淋巴细胞,DCs通过其突起与T淋巴细胞接触联系,而并不是简单地混合在一起。研究表明,去除掉动脉内膜CDllc DCs能使高胆固醇饮食诱导的低密度脂蛋白受体缺陷(Low density lipoprotein receptor deficient, LDLR-/-)小鼠AS病变明显减轻。在免疫应答中,DCs的成熟对于DCs的免疫功能至关重要。成熟的DCs能诱导T淋巴细胞激活,从而进一步导致血管炎症和粥样硬化斑块中的单核细胞浸润。成熟的DCs捕获处理抗原的能力下降和粘附分子(CD54,CD58,CD11a/CD18,CD50)、共刺激分子(CD40,CD80,CD86)和抗原呈递分子(MHCI, MHCⅡ, CD1)的表达上调,细胞因子(IL-12、IL-6、TNF-α)分泌增多,内吞功能下降。此时,成熟DCs能有效的将抗原呈递给初始型T淋巴细胞并使之活化,进而启动免疫应答。研究发现,外来微生物、氧化低密度脂蛋白(oxidized low-ensity lipoprotein, Ox-LDL)、热休克蛋白(HSP-60)都能促进DCs的成熟,增强T淋巴细胞的反应能力。西洛他唑(cilostazol)是一种选择性磷酸二酯酶3(phosphodiesterase3,PDE3)抑制剂,通过抑制血小板及血管平滑肌内磷酸二酯酶的活性,导致血小板及平滑肌内cAMP浓度增加,进而发挥抗血小板作用以及血管扩张作用,在临床上广泛用于治疗周围动脉疾病和缺血性脑血管病。研究表明,西洛他唑除了具有抗血小板作用以及血管扩张作用外,还有抗炎及免疫调节的作用。西洛他唑能明显减小LDLR-/-小鼠及ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的面积,并使斑块局部炎症细胞浸润减少,同时炎症因子的表达下降。在体外实验中,西洛他唑还能抑制脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6、TNF-α以及IL-1的表达。另外西洛他唑在体外能抑制T淋巴细胞的增殖以及炎症因子IL-17、TNF-α和IFN-γ的分泌；同时西洛他唑还能够抑制Th-1及Th-17的分化,增加调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+FoxP3+T cells, Treg cells)的数量。因此西洛他唑无论是在体内还是在体外,均有抗炎和调节免疫的功能。在我们的实验中,通过使用西洛他唑对DCs的成熟来进行干预,观察西洛他唑对DCs成熟功能的调节作用,并且对其机制进行了初步的探讨,以便进一步了解西洛他唑的抗炎及免疫调节功能,了解西洛他唑抗AS的机制,为临床对AS的预防和治疗提供一定的理论依据。全文主要分三章来阐述。第一章：西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟的调节作用。目的：了解西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟作用的影响。方法：通过体外培养DC2.4细胞,用LPS刺激诱导DC2.4细胞的成熟,采用不同溶度的西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞的成熟进行预干预,分别采用流式细胞学、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以及quantitative real-time PCR (qRT-PCR)的方法,来观察DC2.4细胞表面分子CD40、CD86和MHC Ⅱ的表达、内吞功能的情况以及细胞因子IL-6和TNF-α的分泌和其细胞内mRNA的表达。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。数据采甩均数±标准差(x±s)表示,多因素样本均数比较采用析因设计的方差分析,各组均数比较行单因素方差分析或t检验；方差齐时,组间样本均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),两两比较用最小显著差法(least significant difference, LSD),方差不齐时,组间比较用Welch检验,两两比较用Dunnett’s T3方法,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、实验分为4组,重复3次。：各组DC2.4细胞表面分子CD40、CD86以及MHC Ⅱ的表达满足方差齐性(P值分别为P=0.408,P=0.349,P=0.432)。单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞表面分子CD40、CD86以及MHC Ⅱ的表达差异有统计学意义(F值分别为F=129.079、F=83.796和F=80.551,P值均<0.001)。与对照组相比较,经过LPS刺激后,DC2.4细胞表面分子CD40、CD86以及MHC Ⅱ的表达升高(P值均<0.001),采用西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,CD40、CD86以及MHCⅡ的表达下降(P值均<0.001)。2、实验分为4组,重复3次。采用两因素析因设计的方差分析,其结果显示,不同组药物处理对内吞功能的影响有统计学意义(F=10.537,P<0.001),不同温度对内吞功能的影响有统计学意义(F=652.762,P<0.001),两因素有交互效应(F=10.998,P<0.001)。在37℃条件下,各组DC2.4细胞的内吞功能差异有统计学意义(F=12.437,P=0.002)。与对照组相比较,经过LPS刺激后,DC2.4的内吞功能下降(P=0.001),采用西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,DC2.4的内吞功能升高(P=0.004)。3、实验分为5组,重复3次。各组DC2.4细胞培养上清液中IL-6和TNF-α满足方差齐性(P值分别为P=0.317,P=0.406),单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞培养上清液中IL-6和TNF-a的浓度差异有显著性意义(F值分别为F=122.424,F=11.365,P值分别为P<0.001,P=0.001)。与对照组相比较,经过LPS刺激后,细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的浓度升高(P值均<0.001),采用不同溶度西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,10μmol/L、20μmo1/L与40gmol/L西洛他唑预干预后细胞培养上清液中IL-6的浓度下降,差异有统计学意义(P值分别为P<0.029,P<0.001和P<0.001),20μmo1/L与40μmol/L西洛他唑预干预后细胞培养上清液中TNF-α的浓度下降,差异有统计学意义(P值分别为P=0.004,P=0.001)。与LPS组相比较,10μmol/L西洛他唑预干预组细胞培养上清液中TNF-a的浓度差异虽无统计学意义(P=0.134),但浓度也有降低。且随着西洛他唑干预浓度的升高,细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的浓度有所下降。4、实验分为5组,重复3次。各组DC2.4细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达满足方差齐性(P值分别为P=0.057,P=0.213),单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达差异有统计学意义(F值分别为F=52.014和F=56.693,P值均<0.001)。与对照组相比较,经过LPS刺激后,细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达升高(P值均<0.001),采用不同溶度的西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,20μmol/L与40μmol几西洛他唑预干预后细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达下降,差异有统计学意义(P值分别为P=0.007,P<0.001和P值均<0.001),10μmol/L西洛他唑预干预组细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达差异虽无统计学意义(P值分别为P=0.137,P=0.056),但浓度也有降低。且随着西洛他唑干预浓度的升高,细胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达有所下降。结论：1、DC2.4细胞表面低表达细胞表面分子CD40、CD86及MHC Ⅱ,同时具有较强的内吞功能,具备未成熟DCs的特点。2、LPS刺激可诱导DC2.4细胞成熟,使细胞表面分子CD40、CD86及MHCⅡ的表达明显增加,内吞功能下降,同时细胞因子IL—6及TNF—α的分泌及其细胞内mRNA表达水平增强。3、西洛他唑可减弱LPS刺激诱导DC2.4细胞成熟的作用,西洛他唑预干预后,能减弱LPS刺激引起的DC2.4细胞表面分子CD40、CD86及MHC Ⅱ高表达,抑制DC2.4细胞内吞功能的下降,同时减少细胞因子IL—6及TNF—α的分泌及其细胞内mRNA的表达水平。第二章：西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟作用的机制。目的：初步探讨西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟调节作用的机制。方法：在西洛他唑干预前给予cAMP拮抗剂SQ22536,分别采用流式细胞学及ELISA方法测定细胞表面分子CD86的表达及细胞培养上清液中TNF—α的分泌；通过分别给予LPS、西洛他唑及IBMX (3-isobutyl-l-methylxanthine,种非选择性PDE抑制剂)并测定不同药物组细胞内环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate, cAMP)的溶度,了解三种药物对DC2.4细胞内cAMP水平的影响,以进一步了解西洛他唑是否通过细胞内cAMP来抑制DC2.4细胞的成熟；给予不同浓度的西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟进行预干预,采用western blot方法测定核因子κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)的激活情况。通过上述实验,初步探讨西洛他唑对LPS刺激诱导的DC2.4细胞成熟作用的机制。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。数据采用均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,组间样本均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),两两比较用最小显著差法(least significant difference, LSD),方差不齐时,组间比较用Welch检验,两两比较用Dunnett’s T3方法,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、实验分为4组,重复3次。各组DC2.4细胞表面分子CD86的表达和细胞培养上清液中TNF-α的浓度满足方差齐性(P值分别为P=0.37和P=0.168),单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞表面分子CD86的表达和细胞培养上清液中TNF-α的浓度差异有统计学意义(F值分别为F=61.511,15.815,P值分别为P<0.001,P=0.001)。与对照组相比较,经过LPS刺激后,DC2.4细胞表面分子CD86的表达和细胞培养上清液中TNF-α的浓度升高(P值均<0.001),采用西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,CD86表达和TNF-α浓度下降(P值分别为P<0.001和P=0.001),但西洛他唑组与SQ22536组CD86表达和TNF-α浓度差异无统计学意义(P值分别为P=0.753,P=0.907)。2、实验分为4组,重复3次。各组DC2.4细胞内cAMP溶度满足方差齐性(P=0.585),单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞内cAMP溶度差异有统计学意义(F=56.405,P<0.001)。IBMX组细胞内cAMP溶度较对照组升高(P<0.001),LPS组和西洛他唑组细胞内cAMP溶度较对照组差异无统计学意义(P值分别为P=0.696,P=0.721)。3、实验分为5组,重复3次。各组DC2.4细胞胞浆内IκBα和胞核内NF—κ BP65的表达满足方差齐性(P值分别为P=0.238,P=0.057),单因素方差分析结果显示：各组DC2.4细胞胞浆内IκBα和胞核内NF—κ B P65的表达差异有统计学意义(F值分别为F=46.174,F=213.294,P值均<0.001)。与对照组相比较,LPS组胞浆内IκBα的表达下降(P<0.001),胞核内NF-κBP65的表达升高(P<0.001),采用不同的溶度西洛他唑预干预后,与LPS组相比较,胞浆内IκBα的表达升高(P值分别为P=0.012,P<0.001和P<0.001),胞核内NF-κB P65的表达下降(P值分别为P=0.007,P<0.001和P<0.001)。结论：1、LPS刺激诱导DC2.4细胞的成熟作用是通过激活细胞内NF-κB实现的。2、西洛他唑可抑制LPS刺激诱导DC2.4细胞内NF-κB的活化,进而抑制LPS刺激诱导的DC2.4细胞的成熟。3、西洛他唑不影响DC2.4细胞内cAMP水平,且SQ22536不影响西洛他唑对LPS刺激诱导DC2.4细胞成熟的抑制作用,因此西洛他唑抑制内NF--κ B的激活不依赖于细胞内cAMP水平。第三章：西洛他唑对Ox-LDL刺激诱导的人外周血单核细胞源树突状细胞成熟的调节作用。目的：了解西洛他唑对Ox-LDL刺激诱导的人单核细胞源树突状细胞成熟作用的影响。方法：抽取健康成年人外周血20m1,采用Ficoll密度—梯度离心法体外分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC),加入GM-CSF、IL-4联合诱导培养未成熟人单核细胞源树突状细胞,通过加入西洛他唑对Ox-LDL刺激诱导的DCs成熟进行预干预,采用流式细胞学及ELISA方法来观察DCs表面分子CD40和CD86的表达、内吞功能的情况以及细胞因子IL-6和TNF-α的分泌。统计学分析：应用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析。数据采用均数±标准差(x±s)表示,方差齐时,组间样本均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),两两比较用最小显著差法(least significant difference, LSD),方差不齐时,组间比较用Welch检验,两两比较用Dunnett’s T3方法,以P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、实验分为3组,重复3次。各组DCs表面分子CD40和CD86的表达满足方差齐性(P值分别为P=0.793,P=0.612),单因素方差分析结果显示：各组DCs表面分子CD40和CD86的表达差异有统计学意义(F值分别为F=9.647,F=13.250,P值分别为P=0.013,P=0.006)。与对照组相比较,经过Ox-LDL刺激后,DCs表面分子CD40和CD86的表达升高(P值分别为P=0.005,P=0.002),采用西洛他唑预干预后,与0x-LDL组相比较,CD40和CD86的表达下降(P值分别为P=0.049,P=0.029)。2、实验分为3组,重复3次。各组DCs的内吞功能满足方差齐性(P=0.733),单因素方差分析结果显示：各组DCs的内吞功能差异有统计学意义(F=18.941,P=0.003)。与对照组相比较,经过Ox-LDL刺激后,DCs的内吞功能下降(P=0.001),采用西洛他唑预干预后,与Ox-LDL组相比较,DCs的内吞功能升高(P=0.009)。3、实验分为3组,重复3次。各组细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的浓度满足方差齐性(P值分别为P=0.646,P=0.449),单因素方差分析结果显示：各组细胞培养上清液中IL-6和TNF-α的浓度差异有统计学意义(F值分别为F=39.211,F=25.791,P值分别为<0.001,P=0.001)。与对照组相比较,经过Ox-LDL刺激后,细胞培养上清液中的IL-6和TNF-α浓度升高(P值均<0.001)采用西洛他唑预干预后,与Ox-LDL组相比较,细胞培养上清液中的IL-6和TNF-α浓度下降(P值分别为P=0.013,P=0.046)。结论：1、通过Ficoll密度—递度离心法分离外周血单个核细胞,加入GM-CSF、IL-4联合诱导,可以成功获得未成熟的DCs,未成熟的DCs低表达细胞表面分子CD40和CD86,并有较强的内吞功能。2、Ox-LDL刺激可以诱导未成熟DCs的成熟,成熟的DCs表面分子CD40和CD86表达增高,内吞功能下降,炎症细胞因子IL-6和TNF-α的分泌增多；3、西洛他唑可以抑制Ox-LDL刺激诱导的DCs的成熟,西洛他唑预干预后,能减弱Ox-LDL刺激引起的DCs表面分子CD40及CD86高表达,抑制DCs内吞功能的下降,同时减少细胞因子IL—6及TNF—α的分泌。通过以上研究,综合了解西洛他唑对DCs成熟功能的影响及其机制,可为冠心病的防治提供新的理论依据。