自二十世纪八十年代起，特别是1998年人胚胎干细胞建立以后，人们越来越重视干细胞在治疗一些难治性疾病方面的应用，如中枢神经系统(CNS)疾病、心血管疾病和糖尿病。在干细胞移植治疗方面，人们已尝试过胚胎干细胞和成体干细胞（如造血干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞等）治疗相关疾病，并取得了一定的疗效，但胚胎干细胞和成体干细胞在临床上应用还面临很多问题，如安全性、免疫排斥反应、细胞来源有限以及伦理道德等，严重阻碍了干细胞在临床上的应用。近年来，人们发现在哺乳动物羊膜内也存在干细胞，这种干细胞具有多分化潜力，并且有人报道羊膜干细胞的增殖能力要高于骨髓来源的干细胞。羊膜干细胞（amniotic stem cells）的发现和研究为上述干细胞临床应用存在的问题提供了一种可行的解决途径。羊膜干细胞来源于羊膜（Amnion），也可称作胎膜，是与发育中的胎儿联系紧密的胚胎发育早期产物，是母体与胎儿间进行物质交换的重要组织。羊膜干细胞主要分布在羊膜的上皮层和基底层，可表达早期干细胞的一些不同标记，如OCT-4，碱性磷酸酶（AKP），神经细胞特异的胶质纤维相关蛋白（GFAP），神经元特异性标记（MAP2）以及神经干细胞特异性标记（Nestin），肝薄壁组织细胞蛋白等，说明既然羊膜形成于胚胎内细胞团发育早期，就有可能保留未成熟低分化的干细胞，仍保留多分化潜能。同时人羊膜干细胞还具有以下一些特点：1.自身缺乏主要组织相容性复合体I、II类抗原，如HLA-A，B， C和DR以及β2免疫球蛋白，移植后不会产生免疫原性，同时人羊膜细胞又表达HLA-E、G抗原，使其具有免疫抑制活性。2.人羊膜细胞来源非常广泛，不会产生伦理或者道德的问题。3.不具致瘤性。人们已做了大量的研究工作证明了人羊膜干细胞治疗疾病的潜力：Zhao等人发现人羊膜干细胞移植入心脏后，分化成心肌样细胞；Sakuragawa等人报道了羊膜上皮细胞能有效抑制PD大鼠多巴胺能神经细胞的退变，并且使大鼠的疾病行为明显改善；Hideori-Okawa等将大鼠羊膜上皮细胞作为供体细胞移植到脑缺血模型鼠的海马中，发现人羊膜上皮细胞以类似于CA锥体层神经元的方式存活，这一重要结果提示羊膜细胞有转变为神经样细胞的可能，并且具有治疗缺血性脑损伤的潜能；Sankar等发现羊膜上皮细胞能部分恢复脊髓损伤；Wei等报道羊膜上皮细胞能使糖尿病鼠的血糖水平恢复正常，羊膜上皮细胞在体内有潜力分化成β胰岛细胞，提示羊膜上皮细胞有治疗糖尿病的潜力等等。人们还有利用人羊膜细胞作为基因治疗的工程性细胞载体，来治疗一些遗传性疾病，如黏多糖贮积病VII、家族性高固醇血症遗传性肝脏疾病等，也取得不错的效果。在我国，上海中科院细胞研究所已建立和完善了羊膜干细胞的培养平台和羊膜细胞基因改造平台，并在上述基础之上，开展了羊膜干细胞治疗疾病的多项动物研究，包括以帕金森病为代表的神经退行性疾病的治疗，以脑缺血为主的脑损伤治疗，以脊髓损伤为主的神经再生治疗，以耳毛细胞再生为主的神经性耳聋治疗以及糖尿病治疗等，并取得了初步的成果。目前已完成了羊膜干细胞和转基因羊膜干细胞治疗脑缺血性疾病的临床前试验工作，结果表明羊膜干细胞和转基因羊膜干细胞对脑缺血性疾病具有很好的治疗作用。以上众多的有关人类羊膜细胞的基础及动物实验研究均表明该细胞有广阔的临床应用前景，羊膜及其所包含的细胞如果再结合组织工程技术，将能开发出各种生物产品以满足临床各种疾病治疗的需求。本研究着重从羊膜细胞向神经细胞诱导转化、神经修复以及中枢神经系统内移植免疫等方面进行探讨，为临床上应用羊膜细胞修复神经创伤作前期准备。第一部分人羊膜上皮细胞与人羊膜间充质细胞体外分离培养及生物学特性的比较目的：比较人羊膜上皮细胞（AECs）与人羊膜间充质细胞（AMSCs）体外分离培养方法及两种细胞的生物学特性。方法：采取酶消化法分离人羊膜细胞，利用两种细胞居于羊膜组织的不同层次及与羊膜基质不同的附着力各自进行分离培养，通过相差显微镜观察细胞形态，用流式细胞仪检测细胞表面标志的表达并作比较性分析，同时进行克隆化培养及诱导分化实验，将由PHA激发的T细胞与AECs和AMSCs共培养，观察T细胞与两者的相互作用。结果：(1)两种来源的羊膜细胞均贴壁生长，呈现不同的形态外观，两种细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表达CD34、CD45、HLA-DR。(2)AMSCs体外能传代及克隆化培养，AECs则不能，两种细胞在体外均能诱导向神经元样细胞方向分化。（3）两种来源的羊膜细胞在体外对T细胞的活化增殖有明显的抑制作用。结论：人类AECs和AMSCs具有类似的体外生物学特性、表型、多向分化的潜能及其负性免疫调节作用，是一类理想的组织工程种子细胞。第二部分羊膜细胞体外诱导分化及与丝素蛋白支架构建复合体移植对大鼠复合损伤脊髓的修复作用目的：探讨体外羊膜细胞定向诱导分化的方法，羊膜细胞在生物支架上的生长特点，研究种子细胞移植结合组织工程化技术在神经修复中的运用前景。方法：采用酶消化法分离人羊膜组织，分别进行贴壁培养和传代，通过倒置显微镜观察细胞形态，用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达作比较性分析，鉴定AECs及AMSCs，并在诱导剂作用下进行细胞分化实验，重点向少枝胶质细胞方向进行分化干预；构建羊膜细胞与丝素蛋白支架复合体，找到生物支架有利于羊膜细胞生长繁殖的证据；分组进行羊膜细胞移植动物实验研究，从动物行为学、病理切片、免疫细胞化学法、电镜检查等多角度了解组织工程化细胞移植在神经修复方面的积极作用。结果：同是来源于羊膜的两种细胞都呈贴壁生长，但形态却迥异，AECs呈鹅卵石样外观，边界清楚，折光性较强，而AMSCs则呈成纤维细胞样形态，表面标记物表达的差异在于前者表达上皮细胞标记物CK19而不表达CD49d，后者表达CD49d而不表达CK19。人AECs高表达CD29和CD44说明其具有间充质干细胞的表型特征。羊膜细胞经诱导分化后形成少突胶质细胞样细胞，多数表达Galc，部分表达MBP。运用扫描电镜观察体外丝素蛋白支架复合体细胞的生长情况，发现支架的三维多孔结构提高了细胞的粘附和增殖能力，细胞呈立体化生长，相互间的突起联接更多。动物实验行为学结果表明细胞移植组尤其是结合支架的复合移植组动物行为功能恢复远较对照组良好，差异有显著性。组织病理切片及组化实验表明移植物同宿主间整合良好，移植细胞有存活并向神经细胞转化证据。神经示踪技术同样表明了复合支架移植组有更佳的神经轴索修复表现。动物实验结果还证实了丝素蛋白支架有着良好的组织相容性，植入支架复合物的损伤脊髓胶质疤痕形成明显减少，获得了更好的神经修复。结论：羊膜源性干细胞具有多向分化潜能，体外及在体状态都有向神经细胞分化的能力，在生物支架材料上羊膜细胞呈现良好的立体化扩增特点，运用羊膜细胞同丝素蛋白支架构建的复合体移植手术对大鼠的脊髓损伤有着更为理想的修复作用。本实验同时证实在适当转化条件下羊膜细胞可向少突胶质细胞转化，动物实验结果表明，转化后的终末端神经细胞并未展示出在神经修复方面有更多优势，而结合支架应用的组织工程化复合移植策略明显有利于轴索再生及髓鞘形成。第三部分人羊膜细胞负性协同刺激分子PD-L1表达的检测及对中枢神经系统小胶质细胞活化的调控作用目的：探讨人羊膜细胞负性协同刺激分子PD-L1的表达及对体外小胶质细胞(MI)的负性协同作用。方法：用原代培养10天左右的AECs及体外扩增3代的AMSCs，采用流式细胞仪和免疫荧光方法来分析两种细胞协同刺激分子的表达情况，3H-TdR掺入法检测羊膜细胞对脂多糖刺激后的MI增殖的影响，以及PD-L1单克隆抗体部分阻断羊膜细胞抑制MI增殖的影响；流式细胞术分析羊膜细胞对脂多糖作用下MI细胞周期的影响，ELISA法检测细胞因子水平，以及阻断PD-L1作用后的变化。结果：（1）人AECs及AMSCs均不表达CD80、CD83、CD86等正性协同刺激分子，但都较高表达负性分子PD-L1。（2）AECs及AMSCs均可抑制MI体外增殖，并使脂多糖刺激下的MI滞留于细胞周期的G0/G1期，以及调节TNF-α、NO等的分泌，由此表明，羊膜细胞介导的负性免疫调节作用部分是通过高表达PD-L1分子，PD-L1是羊膜细胞表达的主要负性免疫调节分子。结论：人类羊膜细胞在体外具有对MI活化和增殖的抑制作用，其表达的PD-L1分子介导了重要的免疫调节作用。