钩端螺旋体病（Leptospirosis）是由致病性钩端螺旋体（Leptospira,简称钩体）引发的一种广泛传播的,自然疫源性人畜共患病。猪、马、牛、羊、犬、猫等动物以及人类都可被其感染,出现黄疸、流产、肝肾衰竭等病症,严重时还面临死亡的危险。与此同时,患病动物还会不断向周边环境散毒,引起更大范围的感染。因此,需要尽早的对该病做出诊断而实施有效应对的策略。由于目前对钩端螺旋体的PCR检测并不能把我国现存的致病性钩体全部检出,以及显微凝集实验（MAT）实验操作门槛相对较高的,并非所有实验室能够进行,这不利于钩端螺旋体的早期诊断。基于此,本实验建立了针对钩端螺旋体病原的聚合酶链式反应（PCR）检测方法,而且也建立了针对其抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。目前为止,钩端螺旋体的PCR检测是一种较为常用且成熟的实验室检测方法,研究表明,致病性钩端螺旋体都含有的Lip L32基因序列的保守片段。基于此,通过比对我国15群15型钩端螺旋体参考标准株的Lip L32基因序列,设计出了三对退火温度一致的引物。与此期间,其特异性、灵敏度、重复性经过了反复验证,确保其能高效且准确的检测钩端螺旋体。本次实验中,PCR检测钩体浓度最低可达10-6ng/μL。之后在三对引物的基础上,设计了简并碱基引物来进行荧光定量PCR的检测,也经过特异性、重复性、灵敏度的验证,使其能够对实际样本进行有效检测。在检测时,以CT值30为界限:当CT值小于30时,判定其为阳性,反之则为阴性。基于此,建立了钩端螺旋体病PCR检测的方法。虽然显微凝集实验（MAT）是诊断钩体病的金标准,但需要钩端螺旋体活菌以及相关专业人员进行鉴别。这些都不利于钩体抗体诊断的推广普及,针对显微凝集实验的高门槛,为了能够准确地判断出钩体的血清群,本实验建立了一种能够检测钩端螺旋体抗体的ELISA检测方法。首先,分别将15种参考标准株的活菌按设定的免疫程序对家兔进行免疫,程序结束后得到相应的抗血清作为检测抗体,将待检血清进行包被,配合15种灭活的钩体,最后按照所建立的检测方法实现对样本血清中钩体抗体的检测。在450nm的波长下测定吸光值,当检测样本的OD值是阴性血清OD值的两倍时认为其为阳性。之后经行了钩端螺旋体ELISA方法与MAT的对比:从北京某动物医院收集了五只确诊为钩端螺旋体病犬的血清。其中一只犬在2019年9月17日到2019年10月24日之间的不同时间段收集了其血清共6份血清,剩下四只犬分别收集了一份血清用以检测,通过用ELISA方法和MAT进行对比发现,所建立的ELISA,方法和MAT的检出率一致,用MAT判定为阳性且滴度高的,用ELISA方法测定而得出的结果也是如此。针对山东牛场的样本,采用了本实验所建立的普通PCR方法进行了检测,发现11份水样本中,有9份为阳性,其中24头流产母牛中有13头为阳性,3头健康牛中有一头成隐性带菌状态。针对南昌病犬上钩端螺旋体分离株的鉴定,采用PCR方法确认了培养出的细菌为钩端螺旋体,与此同时对病犬的血清进行了MAT和本实验所建立的ELISA方法双重测定,均显示血清中的抗体与澳洲群澳洲型（56607）凝集最为剧烈,且滴度最高,两种方法所得结果一致。以此为基础通过MLST分析,最终得出其为澳洲群澳洲型钩端螺旋体。腹腔注射此菌可造成金黄地鼠的死亡,并发现其肝肾肺有明显的病理损伤,其全致死量的钩体数目为10~8。本实验针对钩端螺旋体病原的PCR检测方法和针对其抗体的ELISA检测方法,能够有效的对钩体病进行鉴别诊断。这不仅有利于临床上对钩端螺旋体的诊断,能够及早发现钩体病,而且对该病的防控也发挥着一定的作用。