旋毛虫病是一种严重的人兽共患病，可感染人及150多种动物，呈世界性分布。近年来在我国17个省、市、自治区发现有多起人体感染的暴发流行。河南省为我国旋毛虫病高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发流行，发病400多人。若不及时诊断和治疗，患者死亡率可高达3％～30％。因而旋毛虫成为我国肉食品卫生检验中的首检寄生虫，开展旋毛虫病的预防和控制工作在我国更具紧迫性和重要性，而预防和控制旋毛虫病的关键在于建立一套快速、简便、特异性高的检测手段以及采取各种有效预防措施降低动物感染率。 目前对旋毛虫病尚无满意的诊断方法，病原学检查检出率低且不易为患者接受。国内外学者对旋毛虫病的免疫学诊断进行了大量的研究，但所用的诊断抗原多为旋毛虫肌幼虫虫体粗抗原，由于抗原成分复杂，用于本病的免疫学诊断时常与其它寄生虫病发生交叉反应而出现假阳性。 对旋毛虫病的免疫预防的研究表明，由于旋毛虫在不同的发育期虫体抗原组分存在明显的差异且同一期虫体抗原结构也极其复杂，且在其长期的寄生生活中，逐渐形成了免疫逃避机制，目前采用成份复杂的虫体抗原往往难以取得理想的免疫预防效果且极不稳定，而且旋毛虫的体外培养仍未取得突破，这都为大规模采用常规免疫方法防治带来了困难。 随着分子生物学技术的发展，使得旋毛虫抗原的体外表达成为可能。与常规抗原相比，基因工程抗原具有纯度高、成分单一、易于大规模生产等优势，为旋毛虫病的免疫诊断和免疫预防提供了新的手段。旋毛虫病的有效诊断和预防的关键为特异性高、保护性强抗原基因的获得，其重要的有效途径之一为构郑州大学川们年硕士论文 旋毛虫5 日龄成虫期特异性基因的分子克隆与表达一建CDNA文库，从中筛选理想的抗原基因。目前利用基因工程方法对旋毛虫的大部分研究主要集中在肌幼虫抗原，由于肌幼虫期是旋毛虫在宿主体内产生免疫逃避最长的时期，形成囊包后可长期寄生于宿主体内，其生命活动处于相对休眠状态，基本不需要表达蛋白，因而其mRNA含量低，所建的文库有效重组子较少，难以筛选到目的基因。据报道，从旋毛虫肌幼虫 C DNA文库中筛选到的克隆编码蛋白抗原的效果并不理想，而成虫期和新生幼虫期是旋毛虫的两个侵袭期，特别是5日龄成虫u L 在其生活史中是旋毛虫的一个特殊时期，在雌性成虫的子宫内含有大量幼虫胚胎，并有少量幼虫排出体外。此期虫体代谢极度旺盛，需要在短时间内合成大量期特异性蛋白，而且其分泌的侵袭因于很可能为ADS与肌幼虫相比所特有的致病因子和强保护性抗原，对宿主免疫作用极为敏感。因此，可以通过构建高质量的 ADS CDNA文库来筛选出其差异性表达北期特异性）的功能性抗原基因，利用基因工程技术将其克隆入载体，并大量表达出有效的单一纯化抗原，对于旋毛虫病的免疫诊断和预防具有重要意义。 材料与方法 本实验在己构建好的ADS差减文库的基础上，应用放射性同位素Q／中标记ADS差减文库CDNA片段T671进行SOLlthCC杂交、探针鉴定，利用地高辛标记此期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交从 ADS CDNA文库中调取其全长CDNA，登陆国际NCBI数据库进行同源性检索及编码蛋白相似性比较。登陆 InterProscan进行氨基酸序列分析。利用信号肽序列分析软件mignal vZ刀）分析预测 XZI编码蛋白的信号肽区域。应用蛋白序列分析软件包 ANTHEPROT4．3分析用1编码蛋白的组成并对其二级结构。亲水性、抗原性及等电点进行预测。根据测序及对 XZI编码蛋白分析结果，考虑到信号肽序列可能对基因的原核表达有影响，利用 ECORI在全长序列的 170 hp处将基因信号肽序列切去。根据未切信号肽序列与去信号肽序列的读码框架，同时分别克隆入表达载体PET28P，构建其原核表达载体PET28K比x、PET28－XZlex。将重组质粒克隆人大肠杆菌DHSA，筛选出阳性克隆，对阳性克隆经酶切鉴定、测序鉴定。经 2郑州大学川0丰硕士论文 旋毛虫5日龄成虫期特异性基因的分子克隆与在这一鉴定构建正确的重组表达载体转化大肠杆菌DE。，对阳性克隆进一步筛选、鉴定并传代培养纯化。将所得工程菌通过IPTG刺激培养，取不同时间培养物裂解液进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酚胺凝胶电泳 旧DS－M＊E）分析，染色后进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量。同时对表达产物进行了Western－blot检测。 结果 1．应用放射性同位素标记进行southern杂交、探针鉴定，结果显示ADS差减文库CDNA片段T671仅与ADS CDNA文库杂交，表明T671为ADS期特异性CDNA探针。 人利用地高辛标记T671期特异性片段，采用两步噬菌斑原位杂交法对ADSCDNA文库筛选，结果获得一 1132hp全长 CDNA）宇列（X21），其中包含 1030hP的开放阅读框架。 3．NCBI基因数据库同源性检索未见相似序列，NCBI蛋白数据库相似性比较表明该基因编码蛋白与表皮胶原蛋白相似性较高卜物％。 4．InterProscan分析显示：氨基酸序列