论文部分内容阅读
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的青年鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要侵害鸡的中枢免疫器官法氏囊,导致免疫抑制和急性死亡。本课题所用IBDV野毒株GX8/99为本实验室分离并鉴定,用适当剂量病毒接种易感鸡,可稳定地引起60%-90%的死亡率,是一个超强毒。为进一步研究GX8/99株的生物学特性及其变异机制,利用本实验室已有的经鸡胚成纤维细胞(CEF)连续盲传22代产生细胞病变后的细胞适应毒,再用无限稀释法将其克隆传代。把克隆毒在SPF鸡上回传23代,取得了一系列的GX8/99传代毒株。为了研究IBDV超强毒GX8/99在传代过程中的毒力变化及其与VP5基因变异的关系,分别用GX8/99原始毒、细胞适应毒及回鸡毒对SPF鸡做了致病性比较,并比较了其VP5基因序列。1.超强毒GX8/99细胞适应毒及回鸡毒的致病性研究超强毒GX8/99株经CEF传代后对SPF鸡的致死率降至0-5%,被显著致弱。但细胞适应毒在回传SPF鸡23代后毒力未见明显增强,表明细胞致弱毒的毒力较稳定。2.GX8/99原始毒及不同传代毒在法氏囊中病毒增殖量的比较将同等量的不同传代毒感染4周龄SPF鸡,感染后3d,5d,7d取法氏囊碾磨液进行倍比稀释,然后用IBDV ELISA试纸条(stripe)检测其中的IBDV含量,以检测到的最大稀释倍数作为法氏囊中的病毒量多少的相对值。与GX8/99原始毒相比,细胞适应毒在法氏囊中的增殖速度要比其原始毒低得多。细胞适应毒在回鸡20代后,在法氏囊内的增殖速度虽然有所恢复,但仍比原始毒低。3.GX8/99细胞适应毒的回鸡毒对SPF鸡的致病性和免疫原性三株细胞克隆毒GXCL2,GXCL4,GXCL5回鸡23代后所得毒株GX-2B23,GX-4B23,GX-5B23,对4周龄SPF鸡的致死率分别为0/15,0/15,1/15。取GX-2B23,GX-4B23免疫2周龄SPF鸡作保护性实验,在免疫后3周用超强毒GX8/99攻毒。GX-4B23,GX-5B23都能造成法氏囊一定程度萎缩,并能显著降低NDV,AIV(H9-和H5-)疫苗的抗体水平。但能使机体产生较强的免疫力,能完全抵抗超强毒GX8/99的人工感染,保护率达100%。4.IBDV野毒株及超强毒GX8/99传代毒株VP5基因的比较对25株不同毒力IBDV的VP5基因的比较表明其同源性都在97%-100%之间,说明VP5整体比较保守。但有8个易发生变异的位点,其中位点bp#2,#52,#145,#385,#409的碱基变异引起了相应氨基酸的改变,而位点bp#18,#232,#331没有引起相应氨基酸的变化。GX8/99原始毒在细胞上传代后在对鸡的致病性减弱的同时,VP5基因的ORF区有5个位点碱基变异并导致编码氨基酸的变化,特别是ORF的第2个碱基由T突变为C后,使起始密码子后移了12个碱基,因而导致细胞传代毒的VP5的N端丢失了4个氨基酸。这种突变与现有的疫苗毒完全一致,但是,对已发表的不同的超强毒及强毒株的VP5基因比较表明,一部分超强毒或强毒株IBDV的VP5基因与GX8/99相同,而另一部分超强毒或强毒株IBDV的VP5基因则与GX8/99株的细胞传代毒相同。显然,在超强毒GX8/99在细胞上连续传代过程中VP5基因那5个位点的突变更可能与适应细胞培养相关,而与致病性并无直接关系。由于超强毒GX8/99细胞适应毒在SPF鸡回传23代后的GX-2B23,GX-4B23仍能诱导机体产生较高的抗体水平,能完全抵抗GX8/99原始毒的人工感染,这表明在传代过程中虽然发生了部分氨基酸的变异,但不同基因上与保护性免疫相关的抗原决定簇未发生明显变异。