血管通透性增高是烧伤早期体液丢失,引发休克和早期全身缺氧性损害的根本原因,其本质是血管内皮通透性的增高。由于其机制一直没有充分阐明,临床上针对烧伤的治疗,尚未找到能降低通透性和减少烧伤输液的有效措施。相对于穿细胞途径,内皮细胞旁途径是烧伤后血管内皮通透性增高的主要途径。研究表明,血管通透性变化与调节涉及细胞骨架重组、粘附连接、紧密连接结构与功能改变等不同的机制。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起通透性增加的共同通路,主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响。p38激酶可能在细胞因子和炎症介质所致的内皮通透性增高中起着重要的信号转导作用,p38 MAPK通过磷酸化下游靶蛋白来调节细胞的功能。目前已发现p38MAPK有5个异构体,激酶分析显示p38α是最主要的活性形式,在炎症反应中起关键作用。钙调素结合蛋白(Caldesmon)分为高分子量Caldesmon(h-Caldesmon)和低分子量Caldesmon(l-Caldesmon)。两者是同一基因的不同拼接型,结构相似。l-Caldesmon可以和维状肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、钙调素相结合。l-Caldesmon在调节细胞骨架的动态平衡中起着重要作用,l-Caldesmon的功能变化在内皮细胞高通透性中扮演了重要角色。一、研究目的探讨p38激酶和Caldesmon在烧伤早期血管通透性变化中的调控作用和机制。二、材料方法1.以体外培养的ECV304细胞和双层培养系统制成单层血管内皮细胞模型。2.实验分组:将细胞分为正常血清组( A组)、正常血清+ SB203580组(B组)、烧伤血清组( C组)、烧伤血清+ SB203580组( D组)、正常血清+重组腺病毒组(E组)、烧伤血清+重组腺病毒组(F组)组、空病毒组(G组)和重组腺病毒组(H组)。3.构建Caldesmon重组腺病毒载体,包装293细胞,制备重组腺病毒。4.采用绿色荧光标记的白蛋白,观察A组、B组、C组、D组、E组和F组单层内皮细胞0.5h、1h、2h、4h时的通透性变化。5. Western blot法检测A组、B组、C组、D组p38、p-p38和p-Caldesmon表达变化以及G组和H组Caldesmon表达变化,利用免疫细胞化学染色观察A组、B组、C组、D组细胞F-actin的形态。三、主要结果1.烧伤血清刺激后,单层内皮细胞的白蛋白滤过明显增加,SB203580预处理明显减少了单层内皮细胞白蛋白滤过。2.正常内皮细胞p38激酶磷酸化水平较低,烧伤血清刺激后,p38激酶磷酸化水平明显增高,SB203580预处理可以明显抑制p38激酶磷酸化水平增高,而p38激酶蛋白表达水平无明显变化。3.正常内皮细胞F-actin排列成束状,与细胞纵轴大致平行,细胞中央和周边无显著差异。烧伤血清刺激后,细胞F-actin明显重排,细胞收缩变圆,SB203580预处理可以抑制F-actin的重排。4.成功构建了Caldesmon重组腺病毒载体,重组腺病毒滴度可达1×109U/ml,重组腺病毒感染内皮细胞后Caldesmon蛋白的表达明显增高。5.重组腺病毒感染内皮细胞明显减少了烧伤血清刺激后单层内皮细胞白蛋白滤过。6.正常内皮细胞磷酸化Caldesmon蛋白水平较低,烧伤血清刺激后,磷酸化Caldesmon蛋白水平明显增高,SB203580预处理可以明显抑制磷酸化Caldesmon蛋白水平增高。四、讨论与结论1.烧伤血清可导致内皮细胞通透性增高,p38激酶活性与烧伤血清导致的血管通透性增加密切相关。2.细胞F-actin重排是烧伤血清刺激后单层血管内皮细胞通透性增高的重要机制,而内皮细胞F-actin重排受p38激酶调控。3.成功构建了Caldesmon重组腺病毒载体,且染效率高,能够有效表达目的基因,具有较高的感染力。Caldesmon蛋白在烧伤血清所引起的单层内皮细胞通透性增高中起重要作用。4.烧伤血清可明显增高内皮细胞磷酸化Caldesmon蛋白水平,而烧伤血清引起的磷酸化Caldesmon蛋白水平增高是由p38激酶活化所致。5. p38激酶/Caldesmon途径是烧伤血清导致血管通透性增加的重要机制,该途径可能通过调节细胞骨架F-actin重排而发挥作用。这为临床防治烧伤早期低容量性休克和全身缺氧性损害提供了新的思路和实验依据。