论文部分内容阅读
肌肉生长抑制素,属TGF-β超家族,是肌肉生长的一个负调控因子,肌抑素基因的突变造成"双肌"现象,显示肌抑素基因在物种进化中的高度保守性.肌肉生长抑制素的突变动物由于肌纤维数目的增加和肌纤维的变粗在骨骼肌的产量上显示大量的增加.采取纯种皮尔蒙特牛全血,提取基因组DNA.根据GeneBank已发表牛Myostatin cDNA的同源序列,选择高度保守区域设计引物,采用PCR的方法从皮尔蒙特牛全基因组中扩增得到Myostatin的三个外显子,将外显子1、2连接构成去除信号肽牛肌抑素基因突变体的Pro区,外显子3的生物活性区,分别克隆于pMD18-T载体,对克隆的目的基因片段测序和酶切鉴定结果表明,其ORF正确.将目的片段克隆于高效原核表达载体pET30a(+)中,组装成表达载体pET30a(+)/Myostatin/Pro和pET30a(+)/Myostatin/action.将这两个表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,N端具有His<,6>肽的融合蛋白重组r Myostation/action得到高效表达,表达产物约占菌体总蛋白的38％.表达产物的表观分子量为15KD,而pET30a(+)/Myostatin/Pro表达量较低,增加表达菌株培养液的盐离子浓度,可提高表达产物的百分含量达到30％,表达产物的表观分子量为26KD.分别将表达蛋白纯化,经柱层析纯化表达产物,表达产物Myostatin/Pro产量约为80ug/mL,Myostatin/action的产量约为60ug/mL.分离绵羊的骨骼肌肌肉细胞,用含10％小牛血清DMEM/F12培养液,在37℃,5％CO<,2>条件下传代培养,该细胞经PBS漂洗、胰酶消化,用上述培养液制成细胞悬液,接种到24孔板继续培养.24h后,吸弃培养液,测定组加入0.5ml培养液和10ul不同浓度Myostatin活性区蛋白样品,对照组加入0.5ml培养液和10ul的PBS,室温孵育20min,再加入培养液使每孔体积为0.8ml,48h后,重复上述步骤,72h后按白细胞计数法,低倍镜下计数肌肉细胞,细胞培养结果表明,目的蛋白对肌肉细胞有增殖和增生的功能.实验首次阐明肌抑素基因工程蛋白对体外培养的骨骼肌肌肉细胞有增生增殖作用,但rMyostatin对细胞分裂周期的影响以及利用基因工程蛋白进行活体注射来阻碍体内自身具有生理作用的Myostatin的功能尚需进一步研究.该实验为阐明牛肌抑素基因的拮抗因子对其抑制作用的缺失并将其作用于活体动物和转基因动物的生产奠定了基础.