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研究背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis , AS)是常见的心脑血管疾病,体内高密度脂蛋白(High density lipoprotein , HDL)降低是AS形成的危险因素之一。法尼酯X受体(Farnesoid X receptor, FXR)是一种参与调控脂代谢的核受体,以鹅脱氧胆汁酸(Chenodexycholicacid, CDCA)为最适天然配体,其基因敲除模型表现出HDL清除率下降。FXR在肝、小肠、肾上腺皮质等组织细胞高表达,而在血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞中有少量表达。FXR可通过调控脂代谢相关基因,而影响血中HDL,LDL,TG的水平。脂质转运抑制蛋白(Lipid transfer inhibitor protein,LTIP),又称载脂蛋白F( apolipoproteinF, apo F),在血浆中主要存在于高密度脂蛋白(High density lipoprotein , HDL)中,少量存在低密度脂蛋白中(Low density lipoprotein,LDL),其生理作用是抑制胆固醇酯转运蛋白(Cholesterol ester transfer protein, CETP)介导的脂蛋白之间的胆固醇酯(Cholesterol ester, CE)和甘油三酯(triglyceride, TG)的交换。CETP介导的这种脂质交换可降低血中HDL的水平,故CETP的人工合成抑制剂被认为有望成为治疗动脉粥样硬化的药物。LTIP作为天然存在的蛋白质分子,发挥抑制CETP活性的作用,LTIP在AS发生、发展中呈负相关。在所查国内外文献中,未见FXR影响LTIP表达的报道。因此,本研究通过观察FXR激动剂对LTIP基因表达的影响及探讨其调控机制,为FXR调节LTIP及在脂代谢中的作用提供实验依据及为心脑血管疾病防治提供新的靶标分子。研究目的:探讨FXR对LTIP表达的影响及可能的分子调控机制研究方法:(1)FXR激动剂CDCA和GW4064分别处理肝细胞系HepG2和L02,24小时后用RT-PCR和real time PCR检测LTIP基因mRNA水平的变化, Western Blotting检测LTIP基因蛋白水平的变化(2)生物信息学方法分析LTIP基因启动子序列,搜索FXR可能的结合位点,分别构建两段含或不含预测的FXR结合位点的序列,构建到报告基因载体pGL3-basic上,通过报告基因实验分析LTIP启动子序列的活性,进而初步确定LTIP启动子区的FXR结合位点所在范围。随后通过染色质免疫共沉淀( Chromatin immuno-precipitation,ChIP)分析培养细胞内FXR与LTIP基因启动子序列FXR结合位点的相互作用。(3)以雄性C57/BL6为动物模型,随机分为三组,以不同剂量的CDCA灌胃处理7天,取肝脏组织提总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western Blotting法检测LTIP mRNA和蛋白水平变化。研究结果:(1)FXR激动剂CDCA和GW4064分别作用于L02和HepG2细胞24 h,随着浓度的增加(CDCA 0μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L; GW4064 0μmol/L,0.02μmol/L,0.2μmol/L,2μmol/L) ,与对照组相比,LTIP mRNA水平均显著升高(P< 0.05),蛋白水平均显著升高(P<0.05),呈剂量依赖型。(2)分析LTIP基因启动子区-3000bp序列,得到可能的FXR结合位点ER1,通过克隆含有ER1结合位点的长序列(-3289～+22bp)和不含有ER1结合位点的短序列( -1872～+36bp ),装载到含有报告基因的质粒pGL3-basic ,得到质粒pGL3-basic/ApoF(-3289～+22bp)和pGL3-basic/ApoF(-1872～+36bp),瞬时共转染和报告基因实验表明含有ER1结合位点的长序列(-3289～+22bp)具有明显的激活转录活性,而不含有ER1结合位点的短序列(-1872～+36bp)不具备转录活性。HepG2细胞经CDCA处理后进行ChIP实验,加入抗FXR抗体的处理组扩增出长为196bp包含LTIP启动子区-2904bp处ER1的序列(-2955～-2759bp),而阴性对照组未有明显扩增,(3)经不同剂量CDCA处理7天后C57BL/6小鼠肝脏组织的mRNA水平和蛋白水平明显升高(P<0.05),呈剂量依赖型。结论:(1)FXR激动剂CDCA和GW4064能显著上调LTIP基因在HepG2和L02细胞中的mRNA和蛋白水平。(2)人LTIP启动子区含有ER1结合位点的-3289～-1872bp的这段序列具有明显的激活转录的活性。包含ER1结合位点的-2955～-2759bp这段序列在HepG2细胞中能与FXR结合,FXR可能通过与ER1结合发挥转录调控作用。(3)FXR激动剂CDCA上调C57BL/6小鼠肝脏组织LTIP的mRNA和蛋白水平