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研究背景:高血糖和高脂血症是诱发肝脏损伤的重要危险因素。硫化氢(H2S)作为一种气体信号分子,在肝脏的生理和病理过程中发挥着重要的作用。已有文献报道,H2S能够发挥拮抗缺血再灌注、对乙酰氨基酚及四氯化碳诱导的啮齿动物肝脏损伤的作用,但关于H2S在高血糖和高脂血症小鼠诱导的肝脏损伤是否具有拮抗作用,目前尚无报道。研究目的:本研究旨在探讨H2S对高血糖和高脂血症小鼠肝损伤的影响,并阐明其潜在的机制。研究方法和结果:动物实验:8周龄健康雄性LDLr-/-小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素(STZ,60mg/kg/day)构建高血糖模型。一周后测小鼠空腹血糖,小鼠空腹血糖>300 mg/dL表明高血糖模型构建成功。继续给予高血糖小鼠高脂饮食(HFD,High fat diet)4周诱导高糖和高脂血症模型。在喂养高脂饮食期间,每天腹腔注射H2S缓释剂GYY4137(50 mg/kg/day)或生理盐水(NS,0.1 mL/day)。造模给药结束后,化学法检测血浆中H2S水平,结果发现,与对照组小鼠相比,高糖和高脂血症小鼠血浆中H2S水平明显下降,GYY4137显著增加血浆中H2S水平。试剂盒检测血浆中肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量的变化。结果显示:高糖和高脂血症小鼠与对照组小鼠相比,ALT和AST水平显著增高,肝脏损伤严重;而外源性给予H2S缓释剂GYY4137可以降低高糖和高脂血症小鼠血浆中ALT和AST的水平,减轻了高糖和高脂血症小鼠的肝脏损伤程度,改善了肝功能。造模给药结束后,称量小鼠体重及肝脏重量。结果显示,高糖和高脂血症小鼠与对照组小鼠相比,小鼠肝脏重量及肝重体重比值显著增高,而外源性给予H2S缓释剂GYY4137处理无显著改善作用。取出肝脏进行切片,HE及油红染色观察肝脏脂肪变性及脂质沉积的变化。结果显示,高糖和高脂血症小鼠与对照组小鼠相比,肝细胞明显空泡变性,脂质沉积严重,而外源性给予H2S缓释剂GYY4137对肝细胞空泡变性及脂质沉积无显著改善作用。DHE染色肝组织切片测定ROS含量变化,GYY4137降低了高糖合并高脂血症小鼠肝脏ROS的含量;Western Blot技术检测高糖和高脂血症小鼠肝组织Nrf2信号通路的变化。结果显示:外源性给予H2S缓释剂GYY4137促进了高糖和高脂血症小鼠肝组织Nrf2的入核,从而上调了 Nrf2调控的下游抗氧化蛋白γ-谷氨酰半胱氨酸酶催化亚单位(GCLC)、血红素加氧酶1(HO-1)及NAPDH醌氧化还原酶1(NQO1)的表达。细胞实验:提取C57BL/6J及Nrf2-/-小鼠原代肝实质细胞,并给予HG(25 mmol/L)和ox-LDL(50 ug/mL)同时处理模拟高糖和高脂血症小鼠肝脏损伤的状态,同时H2S组采用GYY413750 umol/L(G50)或 100 umol/L(G100)预处理 15min,再共同孵育培养。C57BL/6J小鼠原代肝实质细胞上的研究结果显示:Western Blot检测Nrf2在胞浆胞核中的分布,结果显示GYY4137(50、100μmol/L)促进了 HG和ox-LDL诱导的原代肝实质细胞中Nrf2的核转位,但只在GYY4137(100 μmol/L)作用下有统计学差异;DHE活性氧荧光探针染色结果显示,H2S降低了 HG和ox-LDL诱导的C57BL/6J小鼠原代肝实质细胞ROS的生成,而在Nrf2-/-小鼠原代肝实质细胞,H2S对HG和ox-LDL诱导原代肝实质细胞ROS的生成没有减轻作用。Western Blot技术检测了 C57BL/6J及Nr2-/-小鼠原代肝实质细胞Nrf2下游的抗氧化蛋白GCLC、HO-1和NQO1的表达水平。结果显示,相比HG和ox-LDL诱导的Nr2-/-小鼠原代肝实质细胞,GYY4137 100 μmol/L(G100)显著上调了HG和ox-LDL诱导的野生型小鼠原代肝实质细胞Nrf2信号通路下游GCLC和HO-1的表达,而对NQO1的表达没有作用。“Biotin-Switch”法纯化巯基硫化修饰的蛋白后,利用Western Blot技术检测发现,GYY4137(100 μmol/L)处理显著增加Keap1巯基硫化修饰水平;利用免疫共沉淀法观察Keap1-Nrf2之间的相互作用,结果显示GYY4137(100 μmol/L)促进了 HG和ox-LDL诱导的原代肝实质细胞中Nrf2与Keap1的解离。构建Keap1特异性半胱氨酸位点突变的质粒,将Keap1的151位、273位和288位半胱氨酸突变成丙氨酸,转染肝癌细胞HepG2,筛选Keap1发生巯基硫化修饰的位点及探讨该位点的作用。结果发现:Keap1发生巯基硫化修饰的位点主要是151位半胱氨酸位点,而151位半胱氨酸位点被突变后,GYY4137(100 μmol/L)促HG和ox-LDL诱导的HepG2细胞中Nrf2与Keap1的解离及Nrf2入核的作用被阻断。结论:以上结果表明H2S缓释剂GYY4137可能通过改变Keap1的151位半胱氨酸巯基硫化修饰水平,促进Keap1与Nrf2的解离,激活下游抗氧化蛋白的表达,降低ROS的产生以减轻肝脏氧化应激损伤,对高糖和高脂血症诱导的小鼠肝功能起到保护作用。